모델 생물 C. elegans 수동 순환 시스템으로 pseudocoelomic 유체를 사용합니다. 이 유체의 직접 분석은 이전에 수 없었습니다. 여기에 직접 검정 세포 공간을에 소설 기법을 제시하고, 원칙 예제의 증거로 RNAi 반응하는 동안 조직 입을 신호를 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 다루기 쉬운 모델 생물 C. elegans의 성장과 작은 크기의 용이성, 그 짧은 세대 시간으로 활성화, 생물의 질문 무수히으로 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작은 크기는하지만 다른 모델 시스템에서 발견 된 기술적 접근 방법의 수를 금지하고 있습니다. 예를 들어, 포유류의 시스템과 식물의 접목 기술의 수혈은 순환 시스템 조성과 신호의 질문을 수 있습니다. 최근 직접 분석에 불가능 때까지 웜의 순환 시스템 pseudocoelom이 있습니다. 세포 신호 및 순환 시스템을 구성 C.의 질문에 답변하려면 elegans 연구원은 전통적으로 유전자 분석, 세포 / 조직 특정 구조, 그리고 모자이크 분석 해 나가고 있습니다. 이 기술은 세포 사이에 어떤 일이 일어나고 있는지를 추론 할 수있는 수단을 제공하지만, 세포 분자의 식별 및 특성에 보편적으로 적용되지 않습니다. 여기 NE을 제시직접 검정 C.의 pseudocoelomic 유체에 wly 개발 기술 elegans. 기술은 세포 외액의 볼륨을 높이기 위해 중 유전 적 또는 물리적 조작으로 시작됩니다. 이후 동물은 고급 밸런스 압력 제어 할 수있는 microinjection의 장비를 사용하여 vampiric 역방향 microinjection 기술을 받게됩니다. 세포 외액의 분리 후, 수집 된 유체가 다른 동물로 전송 또는 분자에 의해 assayed 할 수 있습니다. 이 기법의 효과를 입증하기 위해 우리는 체계적 RNAi 반응 동안 분석 세포 신호 분자, 긴 dsRNA의 특정 예를에 자세한 방법을 제시한다. 체계적 RNAi의 특성은 원리 예제의 증거이지만, 우리는 순환 시스템 조성과 신호의 질문에 다양한 대답을 적응 것으로이 기법을 참조하십시오.
프로토콜
1. 재료 준비
vampiric 역방향 microinjection에 필요한 재료 유전자 변형 C.를 만들기 위해 사용되는 표준 microinjection 기술에 필요한 비슷하다 elegans 긴장 1. 일부 시약들이 (예를 들어 검정 판) 실험 이전의 날 만든 있지만, 자료의 많은 coordinately 8 일 기간 (시간 테이블에 표 1 참조)를 통해 준비해야합니다. 따라서, 그것은 (필요한 시약 및 장비에 대한 표 2 참조)이 방법을 사용할 때주의 깊게 미리 계획하는 것이 중요합니다.
사출 패드 :
- 용해 될 때까지 2 % 아가로 오스의 H 2 O의 솔루션과 열을 확인합니다. 4 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 1ml aliquots에서 나누어지는 ° C.
- 자신의 가장자리가 약간 빨리 데리러 촉진하기 벤치 상단 가장자리를 돌출이있는 벤치 상단에 22 X 50mm 커버 안경을 놓는다.
- Pokmicrocentrifuge 관의 뚜껑에 EA 작은 구멍은 (압정을 사용) 환기를 할 ....
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토론
여기 모델 유기체 C.에서 세포 외액의 절연 및 특성을 수있는 새로운 방법을 발표 elegans. 기술은 세포 외액 자신의 총 볼륨을 높이기 위해 기증 웜의 유전자 또는 물리적 조작을 시작합니다. 세포 외액은 다음 수정 microinjection 기술을 사용하여 절연하고 있습니다. 웜은 절차를 수행하는 동안 여전히 벌레를 잡아 건조 아가로 오스 패드를 사용하여 microinjection에 장착되어 있습니다. 패드에 대한 물리적 첨부 파일 hydrostatically 곳에서 웜을 보유 할 수있는 드라이 패드의 desiccating 전원을 사용합니다. 웜가 탑재되면 사용할 수있는 세포 물이 기증자 동물로부터 배출되는 시작하기 때문에, 도전을 선물한다. 따라서 신속하게 작동 할 수 필수적입니다. 이 사출 패드에 미네랄 오일에 웜을 중지 할 experimenters에게 도움이 될 수 있지만, 그들을 패드와 접촉을하지. 일에 주입 패드를 장착 한 후전자 현미경 및 웜과 바늘을 정렬은 패드와 접촉을하고 &.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 헌터 연구소의 협력 자연을 인정하고,이 기술의 개발이 가능하고, 즐거운 한 도움이 토론과 도움에 감사합니다. 나이젤 Delaney와 웜과 박테리아 변종에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터를 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 CPH에 GM089795 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
승리 + Carb
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 일 웜 준비 재료 준비 | |||
| -7 사전 | 깨끗한 유지 잘 공급 CLR-1 (e1745)와 N2 웜 | 사출 패드, NGM 플레이트, NGM + Carb / IPTG 접시, OP50 LB 주식을 만들기 | |
| -6 | |||
| -5 | RNAi 음식 박 3 ML의 예방 | ||
| -4 | RNAi 판에 배아 이동 | 종자 RNAi 판 | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | 4 시간 동안 25 웜를 Shift | 검정 접시 만들기 | |
| NGM 플레이트를 청소 벌레를 이동 | |||
| Vampiric 전송 | |||
| 수신자를 복구 | |||
| 1 | 이전 수신자를 제거 | ||
| 2 | 점수 자손 |
표 1. 재료 준비 일정.
소스 (Ahringer 수유 도서관)| 장비 회사 소개 카탈로그 번호 | ||
|---|---|---|
| Picoliter 압력 주입기 | 워너 계측기 | 65-0001 (PLI-100) |
| 불타는 / 브라운 micropipette 풀러 | 셔터 계측기 | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| 시약 | ||
| 미네랄 오일 | EM 과학 | MX1560-1 |
| 22x50없이 1 ½ 커버 유리 | 코닝 | |
| SeaKem LE 아가로 오스 | Lonza | 50,004 |
| 붕규산 유리 모세 혈관 | 세계 Precisions 계측기 | 1B100F-4 |
| 차아 염소산 나트륨 솔루션 (5 % 유효 염소) | JT 베이커 | 9416-01 |
| C. elegans와 박테리아 변종 | ||
| CLR-1 (e1745) II 9 | Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi 벡터 10 | F02A9.6 | |
| PAL-1 RNAi 벡터 11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. 대장균 4 | MC4100-YFP |
표 2. 특정 시약 및 장비.
참고문헌
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
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재인쇄 및 허가
