인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

요약

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

인간 유두종 바이러스(HPV)와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체에 특이적인 희귀 T 세포를 분리하고 특성화하는 어려움을 극복하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 포함된 단계는 피험자로부터 T 세포 에피토프(epitope)를 포함하는 HPV 단백질 영역을 식별하고, 인터페론-γ(IFN-γ) 분비를 기반으로 펩타이드 특이적 T 세포를 선택하며, T 세포 클론을 배양하고 특성화하는 것입니다(Fig. 1). 피험자 1은 최근 생검을 통해 고등급 편평 상피내 병변 진단을 받았으며, T 세포를 수집한 당일에 치료를 위해 루프 전기 절제술을 받은 환자였습니다¹. 중첩 합성 펩타이드를 사용하여 수행한 IFN-γ 효소 결합 면역 스팟(ELISPOT) 분석을 통해 T 세포 에피토프를 포함하는 인간 유두종 바이러스 16형(HPV 16) E6 및 E7 단백질 내 영역이 식별되었습니다(Fig. 2). 이 분석 데이터는 T 세포 에피토프를 포함하는 영역을 식별하는 것뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T 세포의 수를 추정하고 상용 자성 비드(CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA)를 사용하여 IFN-γ 분비를 기반으로 이들을 분리하는 데 사용되었습니다. 선택된 IFN-γ 분비 T 세포는 웰당 단일 T 세포의 성장을 지원하기 위해 조사된 피더 세포 혼합물이 있는 상태에서 희석하여 단독 배양하였습니다. 이러한 T 세포 클론은 필요한 T 세포 클론 세포 수를 최소화하기 위해, 식별된 영역을 커버하는 펩타이드 및 자가 Epstein-Barr 바이러스 변형 B-림프모구 세포(LCLs, Walls 및 Crawford가 설명한 방식대로 획득)²가 있는 상태에서 IFN-γ ELISPOT 분석을 사용하여 스크리닝되었습니다. ELISPOT 분석에서 일반적으로 사용되는 웰당 1 x 10⁵ 세포^1,3 대신, 1 x 10⁵ 자가 LCLs가 있는 상태에서 1,000개의 T 세포 클론 세포를 사용함으로써 필요한 T 세포 클론 세포 수를 획기적으로 줄였습니다. 자가 LCLs는 T 세포 클론 세포에 펩타이드 항원을 제시할 뿐만 아니라, 웰 내의 높은 세포 밀도를 유지하여 에피토프 특이적 T 세포 클론 세포가 IFN-γ를 분비할 수 있도록 하였습니다. 이는 IFN-γ ELISPOT 분석의 성공적인 수행을 보장합니다. 마찬가지로, IFN-γ ELISPOT 분석은 CD8 T 세포 에피토프(HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY)의 최소 및 최적 아미노산 서열과 그 HLA class I 제한 요소(B58)를 특성화하는 데 활용되었습니다. 또한 HPV 16 E6 또는 E7 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCLs를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였습니다. 결과는 E6 T 세포 에피토프가 내인성으로 처리되었음을 보여주었습니다. 다른 고위험 HPV 유형의 상동 T 세포 에피토프에 대한 교차 인식 또한 확인되었습니다. 이 방법은 CD4 T 세포 에피토프를 기술하는 데에도 사용될 수 있습니다⁴.

프로토콜

피험자 1로부터 확립된 CD8 T 세포주를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행한 결과, HPV 16 E6 46-70 영역에 T 세포 에피토프가 포함되어 있음이 확인되었으며¹ (그림 2), 본 프로토콜을 시작하기 전 IFN-γ 분비 여부를 기준으로 에피토프 특이적 T 세포를 선별하였다(그림 1).

1. 에피토프 특이적 T 세포의 한계 희석법

1. 1% pooled human serum가 포함된 complete Yssel's medium을 사용하여, 방사선 조사(4,000 rad)한 동종 말초혈액 단핵구(PBMCs) 5 x 10⁵ cells/ml, 방사선 조사(5,000 rad)한 동종 LCLs 5 x 10⁴ cells/ml, 그리고 phytohaemagglutinin (PHA) 0.1 μg/ml를 혼합하여 feeder cell mixture를 준비한다. 프로토콜 전 과정 동안 세포는 무균 상태에서 취급해야 한다.
2. 분리된 epitope-specific T-cells(Fig. 3)를 feeder cell mixture를 사용하여 농도가 0.5 cell/10....

토론

전통적으로 면역학자들은 관심 대상인 T세포를 in vitro에서 자극하고, 한계 희석 실험을 수행하여 에피토프 특이적 T세포 클론을 분리함으로써 새로운 T세포 에피토프를 특성화하려 시도했습니다. 이후 T세포 클론은 크롬 방출 분석법을 사용하여 특성화되었습니다 ^8,9. 하지만 T세포의 빈도가 너무 낮아 분리할 수 없었거나, 특성화를 완료하기에 충분한 T세포 클론 세포를 확보하지 못해 많은 시도가 실패로 돌아갔습니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 (1) 관심 T세포의 수가 충분한지 평가하고, (2) IFN-γ 분비를 기준으로 T세포를 선택하여 관심 T세포의 빈도를 높이며, (3) 자가 LCL을 T세포 클론 세포와 함께 파종하는 ELISPOT 분석법을 수행함으로써 적은 수의 T세포 클론 세포를 사용하여 이러한 한계점을 극복합니다. 그림 2 는 잠재적 T세포 에피토프가 존재하는 영역을 식별할 뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T세포의 빈도를 평가하기 위해 수행된 ELISPO.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD8 T 세포 분리 키트	Miltenyi Biotec	130-094-156
Phytohemagglutinin	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2mg/vial
Yssel’s 배지	Gemini Bio Products	400-102	1% pooled human serum
96-웰 라운드 바텀 플레이트	BD Biosciences	08-772-17
재조합 인간 IL-2	R&D Systems	202-IL-050	50μg
24-웰 플레이트	Corning	07-200-84
인산 완충 식염수	Cellgro	MT-21-031-CV
1차 anti-IFN-γ 단일클론 항체 (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
비오틴 결합 anti-IFN-γ 단일클론 항체 (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Multiscreen HA ELISPOT 플레이트	EMD Millipore	MAHA S45 10
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	100 ml 병
Pooled Serum, human	Atlanta Biologicals	S40510H	열불활성화
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Vectastain Elite ABC 키트	Vector Laboratories	NC9313719
안정화된 diaminobenzidine	Open Biosystems	MBI 1241
AID EliSpot 리더 클래식	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06