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방법 논문

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

11.5K 조회수

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DOI:

10.3791/3657

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2012년 3월 8일

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1Department of Microbiology and Parasitology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University , 2Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences , 3Department of Pathology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences

이 논문에서

요약

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

인간 유두종 바이러스(HPV)와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체에 특이적인 희귀 T 세포를 분리하고 특성화하는 어려움을 극복하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 포함된 단계는 피험자로부터 T 세포 에피토프(epitope)를 포함하는 HPV 단백질 영역을 식별하고, 인터페론-γ(IFN-γ) 분비를 기반으로 펩타이드 특이적 T 세포를 선택하며, T 세포 클론을 배양하고 특성화하는 것입니다(Fig. 1). 피험자 1은 최근 생검을 통해 고등급 편평 상피내 병변 진단을 받았으며, T 세포를 수집한 당일에 치료를 위해 루프 전기 절제술을 받은 환자였습니다1. 중첩 합성 펩타이드를 사용하여 수행한 IFN-γ 효소 결합 면역 스팟(ELISPOT) 분석을 통해 T 세포 에피토프를 포함하는 인간 유두종 바이러스 16형(HPV 16) E6 및 E7 단백질 내 영역이 식별되었습니다(Fig. 2). 이 분석 데이터는 T 세포 에피토프를 포함하는 영역을 식별하는 것뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T 세포의 수를 추정하고 상용 자성 비드(CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA)를 사용하여 IFN-γ 분비를 기반으로 이들을 분리하는 데 사용되었습니다. 선택된 IFN-γ 분비 T 세포는 웰당 단일 T 세포의 성장을 지원하기 위해 조사된 피더 세포 혼합물이 있는 상태에서 희석하여 단독 배양하였습니다. 이러한 T 세포 클론은 필요한 T 세포 클론 세포 수를 최소화하기 위해, 식별된 영역을 커버하는 펩타이드 및 자가 Epstein-Barr 바이러스 변형 B-림프모구 세포(LCLs, Walls 및 Crawford가 설명한 방식대로 획득)2가 있는 상태에서 IFN-γ ELISPOT 분석을 사용하여 스크리닝되었습니다. ELISPOT 분석에서 일반적으로 사용되는 웰당 1 x 105 세포1,3 대신, 1 x 105 자가 LCLs가 있는 상태에서 1,000개의 T 세포 클론 세포를 사용함으로써 필요한 T 세포 클론 세포 수를 획기적으로 줄였습니다. 자가 LCLs는 T 세포 클론 세포에 펩타이드 항원을 제시할 뿐만 아니라, 웰 내의 높은 세포 밀도를 유지하여 에피토프 특이적 T 세포 클론 세포가 IFN-γ를 분비할 수 있도록 하였습니다. 이는 IFN-γ ELISPOT 분석의 성공적인 수행을 보장합니다. 마찬가지로, IFN-γ ELISPOT 분석은 CD8 T 세포 에피토프(HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY)의 최소 및 최적 아미노산 서열과 그 HLA class I 제한 요소(B58)를 특성화하는 데 활용되었습니다. 또한 HPV 16 E6 또는 E7 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCLs를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였습니다. 결과는 E6 T 세포 에피토프가 내인성으로 처리되었음을 보여주었습니다. 다른 고위험 HPV 유형의 상동 T 세포 에피토프에 대한 교차 인식 또한 확인되었습니다. 이 방법은 CD4 T 세포 에피토프를 기술하는 데에도 사용될 수 있습니다4.

프로토콜

피험자 1로부터 확립된 CD8 T 세포주를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행한 결과, HPV 16 E6 46-70 영역에 T 세포 에피토프가 포함되어 있음이 확인되었으며1 (그림 2), 본 프로토콜을 시작하기 전 IFN-γ 분비 여부를 기준으로 에피토프 특이적 T 세포를 선별하였다(그림 1).

1. 에피토프 특이적 T 세포의 한계 희석법

  1. 1% pooled human serum가 포함된 complete Yssel's medium을 사용하여, 방사선 조사(4,000 rad)한 동종 말초혈액 단핵구(PBMCs) 5 x 105 cells/ml, 방사선 조사(5,000 rad)한 동종 LCLs 5 x 104 cells/ml, 그리고 phytohaemagglutinin (PHA) 0.1 μg/ml를 혼합하여 feeder cell mixture를 준비한다. 프로토콜 전 과정 동안 세포는 무균 상태에서 취급해야 한다.
  2. 분리된 epitope-specific T-cells(Fig. 3)를 feeder cell mixture를 사용하여 농도가 0.5 cell/100 μl 또는 5 cells/1 ml가 될 때까지 연속 희석한다. 이때 epitope-specific T-cells는 약 3 x 103개를 사용한다.
  3. 멀티채널 피펫을 사용하여 희석된 epitope-specific T-cells를 96-well round bottom plate 총 30~60개에 100 μl/well씩 분주한다.
  4. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다.
  5. 5일째에 20 u/ml의 recombinant human interleukin-2 (rhIL-2)가 포함된 complete Yssel's medium 100 μl를 첨가한다.
  6. 96-well round bottom plate 바닥의 펠릿 크기가 큰 것을 통해 성장 중인 T-cell clone을 육안으로 식별한다.
  7. 11~14일째에, complete Yssel's medium을 사용하여 방사선 조사(4,000 rad)한 동종 PBMCs 1 x 106 cells/ml, 방사선 조사(5,000 rad)한 동종 LCLs 1 x 105 cells/ml, PHA 0.1 μg/ml를 혼합하여 새로운 feeder cell mixture를 준비한다. 이 새로운 feeder cell mixture를 24-well plate에 1 ml/well씩 분주한다.
  8. 약 200 μl의 부피를 담을 수 있는 마이크로피펫을 사용하여 각 well에서 T-cell clone을 개별적으로 흡입한다.
  9. 새로운 feeder cell mixture가 담긴 24-well plate에 T-cell clone을 개별적으로 분주한다. 모든 T-cell clone이 옮겨질 때까지 이 과정을 반복한다.

2. 고처리량 스크리닝 ELISPOT 분석법을 이용한 에피토프 특이적 T 세포 클론의 식별 (Larsson et al.5이 설명한 방법을 응용함)

  1. 멸균된 조직 배양 등급의 phosphate-buffered saline (PBS)에 5 μg/ml로 희석한 1차 anti-IFN-γ 단클론 항체(clone D1K, Mabtech, Stockholm, Sweden)를 멸균된 ELISPOT 플레이트(Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) 2개에 웰당 50 μl씩 코팅하여 4 °C에서 최소 1시간 동안 둡니다.
  2. PBS 150~200 μl/well을 분주하고 제거하는 방식으로 웰을 세척합니다. 이 과정을 3회 더 반복합니다.
  3. RPMI 1640을 사용하여 5%로 희석한 풀링된 인간 혈청 50 μl/well을 분주하여 37 °C, 5% CO2에서 최소 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다. 큰 기포가 있는 경우 멸균된 바늘로 터뜨려 제거합니다.
  4. 5% 인간 혈청이 포함된 RPMI 1640 50 μl에 자가 LCLs2 1 x 105개를 웰당으로 분주합니다.
  5. T-cell 클론이 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 1 ml 피펫으로 혼합합니다. 웰당 100 μl를 멸균된 Eppendorf 튜브로 옮깁니다. 각 Eppendorf 튜브에 5% 풀링된 인간 혈청이 포함된 RPMI 1640 500 μl를 추가하고, 마이크로 원심분리기에서 3,000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.
  6. Eppendorf 튜브의 상층액을 따라내고, 튜브당 5% 인간 혈청이 포함된 RPMI 1640 110 μl를 추가한 후 볼텍스를 사용하여 세포를 재부유시킵니다.
  7. 신속한 스크리닝을 위해 세포 수에 관계없이 특정 T-cell 클론이 포함된 배지 50 μl씩을 2개 플레이트의 동일한 위치의 웰에 분주합니다. 모든 T-cell 클론에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포 계수 단계를 생략함으로써 많은 수의 T-cell 클론을 한 번에 테스트할 수 있습니다.
  8. 여러 Eppendorf 튜브의 남은 배지를 합치고, PHA가 추가될 양성 대조군 웰로 사용할 다음 동일 위치의 웰에 50 μl씩 분주합니다.
  9. T-cell 클론이 포함되지 않은 음성 대조군 웰로 사용할 각 웰에 5% 풀링된 인간 혈청이 포함된 RPMI 1640 50 μl를 추가합니다.
  10. 양성 영역(Table 1)에 포함된 펩타이드를 최종 농도가 펩타이드당 10 μM이 되도록 50 μl/well로 추가합니다. 펩타이드 스톡은 펩타이드 용해도에 따라 PBS 내 5%~15% dimethyl suphoxide에 각각 5mM로 용해되어 있습니다. 각 웰의 최종 부피는 200 μl가 됩니다(차단액 50 μl, LCLs 50 μl, T-cell 클론 50 μl, 펩타이드 50 μl).
  11. 양성 대조군 웰에 PHA(최종 농도 10 μg/ml) 50 μl를 추가합니다.
  12. 음성 대조군 웰에 5% 풀링된 인간 혈청이 포함된 RPMI 1640 50 μl를 추가합니다.
  13. 37 °C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  14. 0.05% Tween-20이 포함된 PBS 150~200 μl/well을 분주하고 제거하는 방식으로 웰을 세척합니다. 이 과정을 3회 더 반복합니다.
  15. 1 μg/ml의 biotin-conjugated anti-IFN-γ 단클론 항체(clone 7B-6, Mabtech)가 포함된 PBS 50 μl를 추가하고, 37 °C, 5% CO2에서 2시간 동안 배양합니다. 큰 기포가 있는 경우 바늘로 터뜨려 제거합니다.
  16. 2시간 배양 종료 20분 전에 0.1% Tween-20이 포함된 PBS 5 ml에 용액 A와 용액 B를 각각 2방울씩 추가하여 avidin-bound biotinylated horseradish peroxidase H(Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 준비합니다.
  17. 0.1% Tween-20이 포함된 PBS 150~200 μl/well을 분주하고 제거하는 방식으로 웰을 세척합니다. 이 과정을 3회 더 반복합니다.
  18. biotinylated horseradish peroxidase H 50 μl/well을 분주하고, 37 °C, 5% CO2에서 1시간 동안 배양합니다. 큰 기포가 있는 경우 바늘로 터뜨려 제거합니다.
  19. 0.1% Tween-20이 포함된 PBS 150~200 μl/well을 분주하고 제거하는 방식으로 웰을 세척합니다. 이 과정을 3회 더 반복합니다.
  20. stable diaminobenzidine (DAB)라고 불리는 발색 시약 50 μl/well을 상온에서 5분 동안 분주합니다. 큰 기포가 있는 경우 바늘로 터뜨려 제거합니다.
  21. 탈이온수 150~200 μl/well을 분주하고 제거하는 방식으로 웰을 세척합니다. 이 과정을 2회 더 반복합니다.
  22. 플레이트를 완전히 건조시킵니다.
  23. 해부 현미경 또는 자동 ELISPOT 판독기(AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 스팟 수를 측정합니다.

3. ELISPOT 분석을 이용한 T세포 클론의 에피토프 특이적 성격 확인 (그림 4)

  1. 잘 성장하는 T세포 클론을 선택합니다. 앞서 설명한 방법으로 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 105의 자가 LCL과 1 x 103의 T세포 클론 세포를 해당 영역에 포함된 3종의 펩타이드(표 1)를 각각 10 μM 농도로 함께 분주합니다. 분석은 2회 또는 3회 반복으로 설정합니다.

4. 에피토프의 내인성 처리 여부 결정 (그림 5)

  1. 잘 성장하는 T-세포 클론을 선택합니다. 위에서 설명한 것과 동일하게 ELISPOT 분석을 수행하되, HPV 16 E6, E7 6을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 autologous LCL 1 x 105개(분석 전 감염) 또는 감염되지 않은 LCL(야생형, WR 균주)(감염 다중도 5로 1시간 동안 처리)과 T-세포 클론 세포 1 x 103개를 웰당 분주하여 도말합니다.

5. T세포 에피토프의 최소 및 최적 서열 특성 분석 (그림 6a, 6b 및 6c)

  1. 성장이 양호한 T-세포 클론을 선택한다. 위에서 설명한 대로 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 105 개의 자가 LCL과 1 x 103 개의 T-세포 클론 세포를 해당 영역을 커버하는 일련의 중첩 9-mer 펩타이드(Table 1) 10 μM과 함께 분주한다(Fig. 6a).
  2. 위에서 설명한 대로 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 105 개의 자가 LCL과 1 x 103 개의 T-세포 클론 세포를 길이가 다양한 일련의 펩타이드(Table 1) 10 μM과 함께 분주한다(Fig. 6b).
  3. 위에서 설명한 대로 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 105 개의 자가 LCL과 1 x 103 개의 T-세포 클론 세포를 최소 및 최적 아미노산 서열을 포함할 가능성이 가장 높은 몇 가지 펩타이드와 함께 분주한다. 이 펩타이드들은 10-5 M에서 10-10 M 범위의 농도에서 테스트한다(Fig. 6c).

6. ELISPOT 분석을 이용한 제한 요소 식별 (그림 7)

  1. 잘 성장하는 T 세포 클론을 선택합니다. 위에서 설명한 것과 동일하게 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 103개의 T 세포 클론 세포를 10 μM 농도의 최소 및 최적 펩타이드와 함께 분주합니다. 또한 연구 대상자와 하나 또는 두 개의 HLA class I 분자를 공유하는 동종 LCL을 웰당 100,000개씩 함께 분주합니다.

7. 다른 고위험군 HPV 유형의 상동 아미노산 서열에 대한 에피토프 특이적 T세포 클론의 교차 반응성 연구 (그림 8)

  1. 잘 성장하는 T세포 클론을 선택합니다. 위에서 설명한 것과 동일하게 ELISPOT 분석을 수행하되, 웰당 1 x 103 T세포 클론 세포를 다른 고위험군 HPV 유형의 상동 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(10 μM)와 함께 플레이팅합니다(표 2). 웰당 100,000개의 자가 LCL과 제한적 HLA class I 분자를 발현하는 동종 LCL 또한 각각의 웰에 플레이팅합니다.

8. 대표 결과

여기에 제시된 피험자 1은 생검을 통해 고등급 편평상피내병변(high-grade squamous intraepithelial lesion) 진단을 받은 최근 이력이 있는 22세 아프리카계 미국인 여성입니다. 그녀는 T 세포를 수집한 당일에 루프 전기 절제술(loop electrical excision procedure) 치료를 받기 위해 내원했습니다1. 그녀의 CD8 T-cell line에 대한 ELISPOT 분석 결과, HPV 16 E6 46-70 영역(각 영역은 3개의 중첩된 15-mer 펩타이드로 테스트됨)에 T 세포 에피토프가 포함되어 있음이 확인되었습니다(Fig. 2). IFN-γ 분비 기준으로 선택된 에피토프 특이적 T 세포의 수는 1.2 x 105개였습니다. 선택된 세포의 5분의 1에 대해 한계 희석(limiting dilution)을 수행한 후(Fig. 3), 262개의 T-cell clone을 수집했습니다. T-cell cloning의 첫 번째 시도가 성공적이었으므로 나머지 선택된 세포들은 사용하지 않았습니다. 이들 클론 중 94개에 대해 수행한 고속 스크리닝 ELISPOT 분석에서, ELISPOT 플레이트에서 육안으로 쉽게 식별 가능한 62개의 스크리닝 양성 클론을 확인했습니다. 첫 번째 ELISPOT 분석에서 펩타이드 특이적 T-cell clone이 확인되었으므로 나머지 T-cell clone은 테스트하지 않았습니다. 잘 성장한 8개의 스크리닝 양성 클론을 대상으로 해당 영역을 커버하는 3개의 15-mer 펩타이드를 각각 사용하여 재테스트했습니다(Fig. 4). 모든 T-cell clone은 HPV 16 E6 51-65 펩타이드에 양성을 보였고, 8개 클론 중 6개는 E6 46-60 펩타이드에 양성을 보였으며, E6 56-70 펩타이드에 양성을 보인 클론은 없었습니다. HPV 16 E6 단백질 또는 E7 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL을 이용한 테스트 결과, T-cell clone이 내인성으로 처리된 E6 에피토프를 인식한다는 것이 입증되었습니다(Fig. 5). HPV 16 46-65 영역을 커버하는 일련의 중첩된 9-mer 펩타이드(Table 1)를 이용한 테스트 결과, E6 53-61 펩타이드에서 가장 좋은 반응이 나타났습니다(Fig. 6a). E6 53-61 펩타이드를 포함하는 두 개의 10-mer 펩타이드, E6 53-61 펩타이드에 포함된 두 개의 8-mer 펩타이드, 그리고 두 개의 10-mer 펩타이드를 포함하는 하나의 11-mer 펩타이드를 테스트했으며, E6 52-61 (10-mer) 펩타이드가 가장 일관되게 최소이자 최적의 서열인 것으로 나타났습니다(Fig. 6b). 그러나 T-cell clone #79의 경우 E6 53-61 (9-mer) 펩타이드에서도 동일하게 강한 반응을 보였습니다. 이 T-cell clone을 대상으로 더 넓은 농도 범위에서 이 두 펩타이드를 테스트한 결과, 낮은 펩타이드 농도에서 E6 52-61 (10-mer) 펩타이드가 E6 53-61 (9-mer) 펩타이드보다 훨씬 더 효과적으로 양성 반응을 유지했습니다(Fig. 6c). 목표가 강력한 반응을 보이는 가장 짧은 서열을 정의하는 것이었으므로 더 긴 E6 52-62 (11-mer) 펩타이드는 테스트하지 않았습니다. 최종적으로 E6 52-61 (10-mer) 펩타이드가 최소이자 최적의 서열을 포함하는 것으로 결정되었습니다.

CD8 T-세포 에피토프의 제한적 HLA class I 분자는 피험자와 공통된 한두 개의 HLA class I 분자를 발현하는 동종 LCL을 이용한 ELISPOT 분석법으로 확인할 수 있습니다. 하지만 피험자 1의 경우, ELISPOT 분석에서 높은 배경값이 관찰되어 결과가 불충분했습니다. 이후 크로뮴 방출 분석법(데이터 미제시)을 통해 피험자 1의 HLA class I 제한 분자가 B58임을 확인했습니다. 그림 7은 다른 피험자[Wang et al.이 기술한 바와 같이 E6 75-83 (KFYSKISEY)의 최소 및 최적 서열을 검출하는 것으로 확인된 피험자 A]7의 사례를 보여줍니다. B62 및 Cw3 분자를 발현하는 LCL에서는 높은 양성 반응이 나타난 반면, Cw3를 발현하는 LCL에서는 배경 양성 반응이 나타났습니다. 크로뮴 방출 분석법을 통해 B62 분자가 피험자 A의 제한 요소임을 확인했습니다7.

HPV 게놈의 일부 영역은 잘 보존되어 있으며, HPV 16 E6 52-61 영역과 상동성 서열이 13가지의 다른 고위험군 HPV 유형에서 나타났습니다(표 2). 13가지 고위험군 HPV 유형 중 8가지에서 강력한 교차 인식(HPV 16 E6 52-61 펩타이드에 대한 spot forming unit의 >50%)이 입증되었습니다(그림 8).

ELISPOT 분석을 이용한 T 세포 에피토프 식별 흐름도; 분리 및 분석 과정 포함
그림 1. 새로운 T 세포 에피토프의 특성을 규명하는 일련의 실험을 개략적으로 나타낸 전체 모식도. 본 논문은 위에서 세 번째 상자부터 시작되는 프로토콜을 설명한다.

면역 반응의 막대 그래프, 펩타이드 영역 대비 스팟 형성 단위, E6 우세 피크 관찰됨.
그림 2. T 세포 에피토프를 포함하는 영역을 식별하기 위해 수행된 ELISPOT 분석. 웰당 in vitro로 자극된 100,000개의 CD8 T 세포를 HPV 16 E6 및 E7 단백질 내의 각 영역을 커버하는 3개의 15-mer 중첩 펩타이드(각 10 μM)와 함께 플레이팅하였다. 피험자 1의 이 예시는 E6 46-70 영역에 T 세포 에피토프가 존재함을 보여준다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

세포 배양을 위한 희석 과정 도식, 웰당 0.5개의 세포를 달성하기 위한 단계별 희석.
그림 3. 피더 세포 혼합물을 사용하여 에피토프 특이적 T 세포를 웰당 0.5개의 세포 농도로 희석하는 방법을 보여주는 도식.

클론당 스팟 형성 단위의 막대 그래프; 펩타이드 PHA, E6 46-60, E6 51-65, E6 56-70 비교.
그림 4. 3개의 15-mer 펩타이드를 각각 테스트하여 T 세포 에피토프를 포함하는 하위 영역을 식별하기 위해 수행된 ELISPOT 분석. 대상자 1의 이 예시는 E6 46-60 및 E6 51-65 하위 영역에 에피토프가 존재함을 보여준다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

웰당 스팟 형성 단위 막대 그래프; 클론 #5-79; PHA, E6-Vac, E7-Vac, WR 분석; 면역 반응.
그림 5. T-세포 에피토프가 내인성으로 제시되는지 확인하기 위해 수행한 ELISPOT 분석. 피험자 1의 이 예시는 T-세포 클론이 내인성으로 처리된 E6 에피토프를 인식했음을 보여준다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

펩타이드 반응을 분석한 스팟 형성 단위(SFU) 그래프; 클론 데이터가 포함된 막대 그래프 및 선 그래프.

그림 6. T 세포 에피토프의 가장 짧고 최적화된 펩타이드 서열을 규명하기 위해 수행한 ELISPOT 분석. 가능한 경우 전 과정에 걸쳐 동일한 클론이 사용되었다. (a) 중첩되는 9-mer 펩타이드를 사용하여 수행한 ELISPOT 분석. 피험자 1의 이 사례에서는 에피토프가 E6 53-61 하위 영역에 존재함이 밝혀졌다. (b) 다양한 길이의 펩타이드를 사용하여 최소 및 최적 펩타이드 서열을 식별하기 위해 수행한 ELISPOT 분석. 이 사례에서는 가장 짧고 최적화된 펩타이드 서열이 E6 52-61 펩타이드였으며, 그 다음으로 E6 53-61 펩타이드가 가장 일관되게 나타남이 밝혀졌다. (c) 어떤 펩타이드가 최소 및 최적 서열을 포함하고 있는지 확인하기 위해 수행한 ELISPOT 분석. E6 52-61 펩타이드가 더 낮은 농도에서도 양성 반응을 유지하여, 가장 짧고 최적화된 서열인 것으로 결정되었다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

자가 및 일치 동종 LCL을 비교하여 클론당 림프구 스팟 형성 단위를 나타낸 막대 그래프.


그림 7. 제한 HLA class I 분자를 식별하기 위해 수행된 ELISPOT 분석. 이 예시는 B62 분자가 HPV 16 E6 75-83 에피토프7를 인식하는 피험자 A의 CD8 T-세포 클론에 대한 제한 요소라는 개념을 뒷받침한다. 이는 크롬 방출 분석을 통해 확인되었다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

HPV 면역 반응 막대 그래프; 웰당 스팟 형성 단위; 자가/동종 LCL 비교.
그림 8. 다른 고위험군 HPV 유형의 유사 서열에 대한 HPV 16 52-61 특이적 T세포 클론의 교차 반응성을 평가하기 위해 수행한 ELISPOT 분석(표 2). 피험자 1의 이 사례에서는 조사된 13개의 다른 고위험군 HPV 유형 중 8개에서 유의미한 교차 반응성(HPV 16 52-61 대비 양성률 >50%)이 나타났다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

HPV 유형AA 잔기*서열^
16E6 46-60 (15)RREVYDFAFRDLCIV
16E6 51-65 (15)DFAFRDLCIVYRDGN
16E6 56-70 (15)DLCIVYRDGNPYAVC
16E6 52-62 (11)FAFRDLCIVYR
16E6 52-61 (10)FAFRDLCIVY
16E6 53-62 (10)AFRDLCIVYR
16E6 46-54 (9)RREVYDFAF
16E6 47-55 (9)REVYDFAFR
16E6 48-56 (9)EVYDFAFRD
16E6 49-57 (9)VYDFAFRDL
16E6 50-58 (9)YDFAFRDLC
16E6 51-59 (9)DFAFRDLCI
16E6 52-60 (9)FAFRDLCIV
16E6 53-61 (9)AFRDLCIVY
16E6 54-62 (9)FRDLCIVYR
16E6 55-63 (9)RDLCIVYRD
16E6 56-64 (9)DLCIVYRDG
16E6 57-65 (9)LCIVYRDGN
16E6 53-60 (8)AFRDLCIV
16E6 54-61 (8)FRDLCIVY

* 아미노산의 수는 괄호 안에 표시되어 있습니다.

표 1. 최소 및 최적 항원성 펩타이드 서열을 정의하는 데 사용된 HPV 16 E6 펩타이드의 아미노산 서열.

HPV 유형A A 잔기*서열^
16E6 52-61(10)FAFRDLCIVY
18E6 47-56 (10)FAFKDLFVVY
31E6 45-54 (10)FAFTDLTIVY
33E6 45-54 (10)FAFADLTVVY
35E6 45-54 (10)FACYDLCIVY
39E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
45E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
51E6 45-54 (10)VAFTEIKIVY
52E6 45-54 (10)FLFTDLRIVY
56E6 48-57 (10)FACTELKLVY
58E6 45-54 (10)FVFADLRIVY
59E6 47-56 (10)FAFNDLFIVY
68E6 47-56 (10)FAFGDLNVVY
73E6 45-54 (10)FAFSDLCIVY

* 아미노산의 수는 괄호 안에 표시되어 있습니다.
^ HPV-16 E6 52-61 에피토프와 다른 아미노산 잔기는 굵은 글씨로 표시되어 있습니다.

표 2. 교차 인식 여부를 평가하기 위해 테스트한 HPV 16 E6 52-61 CD8 T-세포 에피토프와 상동성을 가진 고위험군 HPV 유형 펩타이드의 아미노산 서열.

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토론

전통적으로 면역학자들은 관심 대상인 T세포를 in vitro에서 자극하고, 한계 희석 실험을 수행하여 에피토프 특이적 T세포 클론을 분리함으로써 새로운 T세포 에피토프를 특성화하려 시도했습니다. 이후 T세포 클론은 크롬 방출 분석법을 사용하여 특성화되었습니다 8,9. 하지만 T세포의 빈도가 너무 낮아 분리할 수 없었거나, 특성화를 완료하기에 충분한 T세포 클론 세포를 확보하지 못해 많은 시도가 실패로 돌아갔습니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 (1) 관심 T세포의 수가 충분한지 평가하고, (2) IFN-γ 분비를 기준으로 T세포를 선택하여 관심 T세포의 빈도를 높이며, (3) 자가 LCL을 T세포 클론 세포와 함께 파종하는 ELISPOT 분석법을 수행함으로써 적은 수의 T세포 클론 세포를 사용하여 이러한 한계점을 극복합니다. 그림 2 는 잠재적 T세포 에피토프가 존재하는 영역을 식별할 뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T세포의 빈도를 평가하기 위해 수행된 ELISPO...

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공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) 및 NIH 보조금 (R01 CA143130 및 UL1RR029884)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CD8 T 세포 분리 키트Miltenyi Biotec130-094-156
PhytohemagglutininRemel, Thermo Fisher ScientificR-308528012mg/vial
Yssel’s 배지Gemini Bio Products400-1021% pooled human serum
96-웰 라운드 바텀 플레이트BD Biosciences08-772-17
재조합 인간 IL-2R&D Systems202-IL-05050μg
24-웰 플레이트Corning07-200-84
인산 완충 식염수CellgroMT-21-031-CV
1차 anti-IFN-γ 단일클론 항체 (D1K)Mabtech3420-3-1000
비오틴 결합 anti-IFN-γ 단일클론 항체 (7B-6)Mabtech3420-6-1000
Multiscreen HA ELISPOT 플레이트EMD MilliporeMAHA S45 10
Dimethyl SulphoxideSigma-AldrichD2650100 ml 병
Pooled Serum, humanAtlanta BiologicalsS40510H열불활성화
RPMI 1640CellgroMT-10-040-CV
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100ml
Vectastain Elite ABC 키트Vector LaboratoriesNC9313719
안정화된 diaminobenzidineOpen BiosystemsMBI 1241
AID EliSpot 리더 클래식Autoimmun Diagnostika GmbHELR06

참고문헌

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ELISPOTTHPV 16 E6 E7TIFNLCLTHLA IHPV
인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용
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