체외에서 방법 생체내에서 상피 분화가 설명되어 있습니다. 대부분의 바이러스는 바이러스 라이프 사이클의 일부로서 상피 세포를 타겟으로,이 방법은 바이러스를 검사하는 수단을 제공합니다 : 호스트 상호 작용을보다 밀접하게 발생하는 것이 비슷한 것을 생체내에서. 이 기술은 기본 keratinocytes 설립 세포 라인뿐만 아니라, 정상 또는 질병 생검 조직에서 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
organotypic 상피 뗏목 문화의 발달은 체외 시스템을 충실히 recapitulates 상피 분화에 효율적으로 연구자를 제공합니다. 이 시스템에 대한 많은 용도가 있습니다. 예를 들어, keratinocytes의 입체 organotypic 뗏목 문화를 성장하는 능력은 인간 papillomavirus (HPV) 1의 연구에 중요한 이정표가되었습니다. HPV의 라이프 사이클은 긴밀하게 편평 상피 2의 분화에 링크되어 있습니다. 같은 Organotypic 상피 뗏목 문화가 여기에 바이러스 생산 3,4,5 포함한 전체 papillomavirus 수명주기를 재현 보여주었다. 또한, 이러한 뗏목 문화가 HPV와 생체내 감염에 따라 관찰 비슷한 dysplastic 병변을 나타냅니다. 따라서이 시스템은 또한 상피 세포 암뿐만 아니라, 일반적으로 상피 세포 분화에 대한 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 원래 Asselineau 및 Prunieras 개발한 외 7.에 의해 수정, organotypic 상피 뗏목 문화 시스템이 콜라겐으로 세포의 성장과 관련된 일반적인, 비교적 쉬운 문화 모델로 성숙 공기 - 액체 인터페이스 (그림 1A)에서 관리하고 플러그. 10-14일의 과정 동안, 전지 계충화하다과 차별화, 차별화 특정 cytokeratins을 생산하고 전체 두께 상피 형성. 수확 보트는뿐만 아니라 표준 분자 및 생화 학적 기법으로, histologically 검사를 할 수 있습니다. 이 문서에서는 기본 인간 keratinocytes에서 뗏목 문화의 생성을위한 방법을 설명합니다. 동일한 기술은 설립 상피 세포 라인과 함께 사용할 수 있으며, 쉽게 정상 또는 질병 biopsies 8 시부터 상피 조직을 사용하기 위해 적용할 수 있습니다. 많은 바이러스가 대상 중 피부 또는 점막 상피 자신의 replicative 수명주기의 일부로. 지난 몇 년 동안의 가능성은 organotypic 뗏목 예찬에게 사용바이러스 숙주 세포 상호 작용을 연구하는 방법으로서 ures는 여러 herpesviruses뿐만 아니라 adenoviruses, parvoviruses 및 poxviruses 9 보여줘왔다. Organotypic 뗏목 문화는 따라서 바이러스 pathogenesis를 조사하기 위해 적응하고, 영구 세포 라인에 cultivable없는 이들 바이러스 소설 항바이러스 대리인을 테스트하는 유일한 수단입니다 수 있습니다.
프로토콜
1. Organotypic 뗏목 문화를위한 준비
- 금속 뗏목 격자가 훨씬 먼저 분화 과정을 방해할 수있는 찌꺼기를 제거하는 삼가의 크롬을 함유하는 제품 황산으로 처리됩니다. 한 시간 만이라도 황산이 들어있는 유리 비커에 잠그다 금속 격자는 다음 지속적으로 수돗물로 씻어서 하룻밤. 린스 하룻밤 후, 뗏목 격자가 이중으로 증류수에 3-5시간 위해 씻어서되어야합니다.
- 보트에 대한 지원을 제공하기 위해 서로 동등한 거리에서 0.5 cm에 대한 뗏목 세 가지 측면을 구부. 금속 격자 그런 다음 autoclaved해야합니다.
- 2.2 g NaHCO3 및 4.8 g의 Hepes을 추가하여 10X reconstitution 버퍼를 준비합니다. 0.05 M NaOH의 100 ML에 디졸브. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장
- 나트륨 중탄산염없이 10X DMEM을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장
- 마우스 표피 성장 인자를 준비 : EGF의 100 MG와 B의 10 밀리그램을 디졸브SA 10 ML에서 각각 ddH 2 0를 deionized. EGF와 BSA를 결합 및 100 ML의 총 볼륨의 deionized ddH ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기서 일반적으로 상피 분화를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하지만, 또한 쉽게 바이러스성 pathogenesis뿐만 아니라 잠재적인 치료제의 효능을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다. 많은 바이러스 herpesviruses와 마찬가지로 HPV의 경우처럼, 또는 바이러스 생활주기의 어느 시점에서 감염의 주 사이트로서 중 상피 세포를 타겟팅합니다. 숙주 세포의 상호 작용 : organotypic 뗏목 문화를 성장하는 것은 많은 시간이 소요, 바이러스를 검사하는 매우 유용한 방법을 제공 충실히 생체내 상피 분화에 요점을 되풀이하는 능력이지만. 성공적으로 완전히 차별화된 상피 성장을 위해서는 인정되어야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 뗏목 문화에 차별하는 능력을 유지하기 위해, 하나는 keratinocyte 단일층을 유지하기 위해 콜라겐 겔의 fibroblast 모이통의 충분한 숫자가 있어야합니다. 뗏목 문화의 가난한 차별도 keratinocytes의 밀도가 너무 낮은로 인해 수콜라겐의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
저자 E1E4 항체의 종류 선물 샐리 로버츠 (버밍엄 대학, 버밍햄 영국) 감사드립니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (4R00CA137160-03)에서 교부금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354,236 | |
| NaHC0 세없이 DMEM | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC0 3 | 시그마 | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391,338 | |
| 스테인레스 금속 격자 | 윌리엄스와 기질 (주) | CR-03063-040-100-S | |
| 전자 매체 11 | |||
| 표피 성장 인자 | BD Biosciences | 354,010 |
참고문헌
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
