의 metabolomic 프로필 Mycobacterium 결핵 국물 문화의 성장 후 결정됩니다. 조건이 미생물의 대사 프로필에 영양 보조제, oxidants, 그리고 안티 - 결핵 요원의 효과를 테스트하기 위해 다양한 수 있습니다. 추출 준비를위한 절차 1D 모두 적용됩니다 1 H 및 2D 1 H- 13 C NMR 분석.
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이 논문에서
요약
초록
Mycobacterium 결핵은 세계적 규모의 인간의 사망의 주요 원인입니다. 모두 다 (MDR)과 광범위하게 - (XDR) 약제 내성의 변종의 출현은 현재 질병 관리 노력을 탈선 위협하고 있습니다. 따라서, 현재보다 더 효과적인 의약품 및 백신을 개발하기 위해 긴급한 필요가있다. M.의 게놈 결핵은 10 년 이상 알려져 아직 유전자 기능과 본성에 대한 지식의 중요한 차이가 있습니다되었습니다. 많은 연구가 이후 유전자 발현의 글로벌 패턴에 마약, oxidants, 그리고 성장 조건의 효과를 결정하기 위해 transcriptomic 및 proteomic 수준 모두에서 유전자 발현 분석을 사용했습니다. 궁극적으로, 이러한 변경 사항의 최종 응답은 몇 천 작은 분자량의 화학 물질을 포함하여 세균의 대사 구성에 반영됩니다. 치료 또는 TR하거나, 야생 유형 및 돌연변이 변종의 대사 프로파일을 비교특정 약물과 함께 eated 효과적으로 목표 식별을 허용 할 수 및 안티 결절 활동으로 소설 억제제의 발전으로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, metabolome에 두 개 이상의 조건의 영향도 평가 할 수 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR)은 신진 대사 중간체를 식별하고 정량화하는 데 사용됩니다 강력한 기술입니다. M.의 준비를 위해이 프로토콜의, 절차 NMR metabolomic 분석을위한 결핵 세포 추출물이 설명되어 있습니다. metabolites의 보존을 최대화하기 위해 차가운 온도를 유지하면서 세포 문화는 적절한 조건 및 필요한 바이오 레벨 3 억제, 1 수확에서 성장하고, 기계 용해를 받게됩니다. 세포 lysates가 회복되며, 소독, 그리고 매우 낮은 온도에서 저장 필터링. 이러한 세포 추출물에서 Aliquots이 가능한 세포의 부재를 확인하기 위해 집락 형성 단위 미들 7H9 한천에 도금되어 있습니다. 37 번 부화 두 달 ° C, 경우에 따라 더 바이올라 없습니다수 식민지가 관찰되며, 샘플은 하류 처리를위한 밀폐 시설에서 제거됩니다. 추출물은 동결 건조 된 진정제를 맞았을 버퍼에 resuspended하고 통계 분석의 대상이되어 spectroscopic 데이터를 캡처, NMR 장비에 주입되어 있습니다. 설명되어있는 절차는 (1D) 한 차원 1 H NMR 및 2 차원 (2D) 1 H-13 C NMR 분석 모두에 적용 할 수 있습니다. 이 방법론은 크로마토 그래피 방법보다 더 신뢰할 수있는 작은 분자량 대사 식별 및 세포 추출물 신진 대사 작품보다 안정적이고 민감한 양적 분석을 제공합니다. 절차의 변화가 세포 용해 단계에 따라 설명이 병렬 proteomic 분석을 위해 적용 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 프로토콜 텍스트
이 프로토콜은 M.에 NMR 방법론의 적응을 강조 결핵 (클래스 III 에이전트). M.을 실시 할 때 따라서 바이오 레벨 3 (BSL3) 관행 준수해야 매년 인증 실험실에서 결핵 연구. 실험실에서 생성 된 에어로졸에 노출이 미생물과 협력 요원에 의해 발생하는 가장 중요한 위험합니다. 다음 절차는 우리 기관에서 실시하고 있습니다 및 변형은 기관 바이오위원회의 권고에 따라있을 수 있습니다. 일반 직원은 보호 장비는 Tyvek 옷, bouffant 모자, 덧신, N95의 인공 호흡기, 눈 보호, 소매 및 니트릴 장갑의 두 쌍 구성됩니다. M. 관련된 작업 오픈 M.과 결핵 문화 및 / 또는 조작 결핵 용기는 타입 A2 또는 B2 생물학적 안전 캐비닛에 수행됩니다. 플라스틱으로 덮인 흡수 종이는 w에 위치표면을 orking. 폐기 또는 시설에서 제거 할 모든 자료 / 소모품은 두 개의 생물학적 가방에 배치하고 autoclaving하여 소독해야합니다. 작업 표면과 캐비닛 (FastPrep-24 용해 균질, 분광 광도계, 얼음 양동이 등)에서 활용 장비는 1 % Amphyl (tuberculocidal, bacteric....
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토론
연구의 상당수는 M.의 transcriptomic 및 proteomic 프로필을 분석 한 체외 및 생체 조건에서의 다양한 미만의 결핵. 11-16 궁극적으로 유전자 발현 및 효소 활동의 변화는 작은 분자량 분자의 농도의 변화로 이어집니다. 이 화합물의 전체 설명은 metabolome을 구성합니다. 따라서, 신진 대사 경로에 마약과 다양한 성장 조건의 효과는 metabolomic 분석 다음 될 수 있습니다. 17,18 몇몇 연구 M.의 신진 대사 경로를 연구하기이 방법의 장점을 데리고 결핵 (아래 참조)과 다른 하나는 mycobacteria, 또는 M.에 감염된 쥐 신진 대사 변화를 분석하는 데 결핵. 19
이 방법의 잠재적 인 함정은 샘플의 일부 미생물이 완전히 lysed되지 않을 수 있습니다. 필요한 경우.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 프로토콜을 개발하면서 도움이 의견 박사 Barletta 박사의 힘 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 도움이 토론 및 교정을 위해 웬디 오스틴 감사드립니다. 이 원고에 설명 된 작업은 네브라스카 - 링컨 산화 환원 생물학 센터 (부모 부여 # NCRR 2P20RR 017675, D. 베커, PI)의 대학에서 위에 나열된 각 조사자에 씨앗 파일럿 교부금의 지원을받는되었다. 또한, 우리는 연구 용품 및 본 출판물에 포함 된 NMR 기법을 표준화 씨 Halouska의 부분 급여 지원을위한 그녀의 R21 부여 (1R21AI087561-01A1)에서 자금을 제공하기 위해 박사 오필리아 Chacon 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 장비의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| ADC 농축 | BD BBL 미들 | 212352 | |
| 절대 후퇴-120 샘플 체인저 | Bruker | ||
| Bruker 이동이다 NMR | Bruker | 500 MHz의 | |
| 소 혈청 알부민 | 피셔 과학 | BP1600-100 | 분수 V |
| 원심 분리기 | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | Allegra X-15R | Benchtop |
| 원심 분리기 튜브 | 코닝 | 430291 | 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 |
| 극저온 튜브 | 코닝 | 430488 | 2.0 ML 멸균 폴리 프로필렌 |
| Cycloheximide | AG 과학 | C-1189 | 유독 한 |
| D (+) - 포도당 | ACROS | 41095-0010 | |
| 중수소 산화물 | 시그마 알드리치 | 617385 | |
| Erlenmeyer 플라스크 | VWR | 89095-266 | 살균, 평면 기지, 폴리 카보네이트, 0.22 μm PTFE 막 환기 캡 |
| 플래시 프리즈 플라스크 | VWR | 82018-226 | 750 ML |
| 건조기를 고정 | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| 글리세린 | GibcoBRL | 15514-029 | |
| 보육기 | 뉴 브런 즈윅 | Innova 40 | Benchtop 흔드는 |
| Lysing 매트릭스 B | MP의 Biomedicals | 6911-100 | |
| 용해 기계 | MP의 Biomedicals | 에프astPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | Microfuge 22R | Benchtop |
| 미들 7H9 국물 | Difco | 271310 | |
| NMR 튜브 | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC 강화 | BD BBL 미들 | 212351 | |
| 올레산 | 시그마 | O1008 | |
| 이염 기성 인산 칼륨 | VWR | BDH0266 | |
| 인산 칼륨 일 염기의 | VWR | BDH0268 | |
| 회 전자 - Microfuge 22R | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | F241.5P | 봉인 및 폴리 프로필렌 |
| 회 전자 - Allegra X-15R | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | SX4750 | 바이오 인증 표지가있는 |
| 나트륨 염화물 | 피셔 과학 | S271-3 | |
| 나트륨-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 | 캠브리지 동위 원소 | DLM-48 | |
| 분광 광도계 | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | DU-530 | |
| 분광 광도계 큐벳 | 생명선 | LS-2410 | 1.5 ML의 폴리스티렌, 2 맑은 편 |
| 주사기 | Becton 디킨슨 | 309585 | 살균, 3 ML Luer - 무사히 다녀 오게 |
| 주사기 필터 | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm 멸균 셀룰로스 아세테이트 |
| 십대 초반 80 | 피셔 과학 | BP338-500 |
참고문헌
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol<....
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