Mechanosensory 세포는 내이 (内耳)의 수용체 세포입니다. 최고의 특성화 체외에서 모델 시스템은 어른 생쥐에서 utricles의 장기 문화를 활용합니다. 우리는 성인 마우스 utricle의 절개를 제시하고, 우리는 교양 utricles에 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염을 보여줍니다.
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정오 공지
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요약
초록
청력 손실 및 밸런스 교란은 주로 내이 (内耳)의 수용체 세포가 mechanosensory 세포의 죽음으로 인해 발생합니다. 만족스럽게 포유 동물 세포를 대표하는 어떤 세포 라인이 없기 때문에, 세포에 대한 연구는 주요 장기 배양에 의존합니다. 성인 쥐 (그림 1) 1-6에서 utricles의 장기 문화를 활용하여 성숙한 포유 동물 세포의 체외 모델 시스템에서 최고의 특성화. utricle은 vestibular 기관이며, utricle의 세포는 청각 기관, Corti의 기관에있는 세포의 구조와 기능 모두에서 비슷합니다. 성인 마우스 utricle 준비는 생존, 항상성, 이들 세포의 죽음을 조절 분자 신호의 연구에 대한 성숙한 감각 상피를 나타냅니다.
포유 동물 달팽이 세포는 불치병에 차별하고 그들이 길 잃었을 때 다시 생성되지 않습니다. 비 이맘에서malian 척추 동물, 청각 혹은 vestibular 머리카락 세포 사망은 청력과 균형 기능을 7, 8을 복원 강력한 재생이옵니다. 모발 세포 재생은 감각 상피 9, 10 세포의 basolateral 표면에 문의 glia 같은 지원 세포에 의해 매개된다. 지원 세포는 머리카락 세포의 생존과 사망 11 중요한 중재자입니다. 우리는 최근 아데노 바이러스를 사용하여 교양 utricles에 세포를 지원하는 감염 기법을 개발했습니다. CMV 프로 모터의 제어하에 GFP를 포함하는 transgene을 전달하기 위해 아데노 바이러스 타입 5 (dE1/E3)를 사용, 우리는 구체적으로 그 아데노 바이러스를 찾아 효율적으로 지원하는 세포를 감염. 세포 감염 효율을 지원하는 것은 약 25-50%이며, 세포는 (그림 2) 감염되지 않습니다. 중요한 것은 우리가 세포를 지원하는 adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포에 독성을 초래하지 않는 것을 발견, 같은 광고-GFP INF에있는 셀 카운트ected utricles가 아닌 감염된 utricles (그림 3)에있는 것과 같습니다. 따라서 교양 utricles 셀을 지원 아데노 바이러스 - 매개 유전자 표현이 머리 세포 생존, 죽음, 그리고 중생의 중재자로서 세포를 지원하는 역할을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.
프로토콜
1. Utricle의 해부와 문화
- 승인된 프로토콜과 목을 벨을 사용하는 성인 (4 세 주 이상) 마우스를 안락사.
- 머리 양쪽에 외부 유스 타키 오관을 자르지하고 코를 향해 전진 피부를 당기십시오. 뒤에서 앞으로 머리를 이등분하고 골질 미로를 표시하는 방법으로 양측의 두뇌를 제거합니다.
- 멀리 뼈다귀 달팽이관에서 두개골을 손질하고 해부 현미경을 갖춘 조직 문화 후드에 골질 미로를 (bulla 포함) 전송 (참고 : 아데노 바이러스 작업 클래스 II 생물 학적 안전 캐비닛에서 수행되어야한다).
- 후드에서 멸균 해부 미디어를 포함하는 35mm 조직 배양 접시 (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (그림 1A) 각 달팽이관을 전송.
- 청각 bulla가 여전히 그대로있다면 (그것은 bulla과 정점 사이에 작은 이미지를 삽입하여 총 해부 동안 bulla를 제거하는 것이 가능달팽이관)는 bulla를 (그림 1B) 부수 (하나 # 3와 하나 # 5) 2 포셉을 사용합니다.
- 꼭대기,베이스, ossicles, 타원형 및 원형 창문 VIIIth의 신경 뿌리, 반원의 운하 (그림 1 C, D)....
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토론
감각 세포는 노화, 소음 외상, 그리고 aminoglycoside의 항생제와 antineoplastic 에이전트 cisplatin을 포함 ototoxic 약물에 대한 노출을 포함하여 스트레스의 다양한 의한 죽음에 감염될 수 있습니다. 영구적인 청력 손실 및 / 또는 균형 장애의 포유 동물 털 세포 사망 결과입니다. 체외 모델 시스템에서 세포와 분자 메커니즘 밑에있는 머리 세포 죽음뿐만 아니라, 머리카락 세포 사망을 방지하거나 반대를 대상으로 이러한 결정을 목표로 연구를위한 중요한 도구입니다 . 성인 포유류에서 달팽이 세포와는 달리, utricle의 세포는 문화에 잘 남아있다. Utricle 머리 전지는 노출에서 달팽이 세포에 독성이있는 동일한 치료 약물 및 ototoxic 헤어 세포 죽음과 생존 utricular와 달팽이 모두 세포 12-18위한 유사 근간 세포의 메커니즘에 대한 죽음에 민감합니다. 또한, 언제 utricle 모델 시스템에서 얻어진 데이터를 처리할 수 있습니다생체내에서.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 난청과 기타 통신 장애의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 추가 지원이 NIDCD 5R01 DC007613에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 회사 소개 카탈로그 번호 | |||
| 중형 199 | Gibco / Invitrogen | 12,350 | |
| DMEM/F12 | Gibco / Invitrogen | 11,320 | |
| 파인 포셉 (# 55) | 파인 과학 도구 | 11255-20 | |
| 파인 포셉 (# 5) | 파인 과학 도구 | 11252-30 | |
| 포셉 (# 3) | 파인 과학 도구 | 11231-30 | |
| 페니실린 G | 시그마 | P3032 | |
| 태아 소 혈청 | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc 미니 트레이 | 피셔 | 12-565-68 | |
| 아데노 바이러스-GFP | 벡터 Biolabs | 1060 * | |
| 칼 - 전 decalcifier | 피셔 | CS510-1D | |
| 나트륨 borohydride | 시그마 | 452,882 | |
| 안티 - 마이 오신 7A (polyclonal) | 프로 테우스 Biosciences | 25-6790 | |
| 안티 - 마이 오신 7A (단클론) | 발달 연구 하이 브리 도마 은행 | MYO7A 138-1 | |
| 안티 Calmodulin | 시그마 | C 3545 | |
| 안티 Calbindin | Chemicon | AB1778 | |
| Fluoromount G | 남부 바이오 어소 시에이츠 | 0100-01 |
표 1. utricle 문화와 아데노 바이러스 감염에 사용되는 시약 및 도구.
*주의 : AD-GFP는 일반적으로 1x10의 주식 titer에서 벡터 Biolabs에 의해 제공됩니다 10 PFU / ML. 우리는 1.2 × 10의 titer에서 재고 바이러스를 제공하기 위해 사용자 정의 증폭을 요청 11 PFU / ML.
참고문헌
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death ....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
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