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방법 논문

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

23.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3734

⸱

2012년 3월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina, 3National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

이 논문에서

정오 공지

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요약

Mechanosensory 세포는 내이 (内耳)의 수용체 세포입니다. 최고의 특성화 체외에서 모델 시스템은 어른 생쥐에서 utricles의 장기 문화를 활용합니다. 우리는 성인 마우스 utricle의 절개를 제시하고, 우리는 교양 utricles에 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염을 보여줍니다.

초록

청력 손실 및 밸런스 교란은 주로 내이 (内耳)의 수용체 세포가 mechanosensory 세포의 죽음으로 인해 발생합니다. 만족스럽게 포유 동물 세포를 대표하는 어떤 세포 라인이 없기 때문에, 세포에 대한 연구는 주요 장기 배양에 의존합니다. 성인 쥐 (그림 1) 1-6에서 utricles의 장기 문화를 활용하여 성숙한 포유 동물 세포의 체외 모델 시스템에서 최고의 특성화. utricle은 vestibular 기관이며, utricle의 세포는 청각 기관, Corti의 기관에있는 세포의 구조와 기능 모두에서 비슷합니다. 성인 마우스 utricle 준비는 생존, 항상성, 이들 세포의 죽음을 조절 분자 신호의 연구에 대한 성숙한 감각 상피를 나타냅니다.

포유 동물 달팽이 세포는 불치병에 차별하고 그들이 길 잃었을 때 다시 생성되지 않습니다. 비 이맘에서malian 척추 동물, 청각 혹은 vestibular 머리카락 세포 사망은 청력과 균형 기능을 7, 8을 복원 강력한 재생이옵니다. 모발 세포 재생은 감각 상피 9, 10 세포의 basolateral 표면에 문의 glia 같은 지원 세포에 의해 매개된다. 지원 세포는 머리카락 세포의 생존과 사망 11 중요한 중재자입니다. 우리는 최근 아데노 바이러스를 사용하여 교양 utricles에 세포를 지원하는 감염 기법을 개발했습니다. CMV 프로 모터의 제어하에 GFP를 포함하는 transgene을 전달하기 위해 아데노 바이러스 타입 5 (dE1/E3)를 사용, 우리는 구체적으로 그 아데노 바이러스를 찾아 효율적으로 지원하는 세포를 감염. 세포 감염 효율을 지원하는 것은 약 25-50%이며, 세포는 (그림 2) 감염되지 않습니다. 중요한 것은 우리가 세포를 지원하는 adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포에 독성을 초래하지 않는 것을 발견, 같은 광고-GFP INF에있는 셀 카운트ected utricles가 아닌 감염된 utricles (그림 3)에있는 것과 같습니다. 따라서 교양 utricles 셀을 지원 아데노 바이러스 - 매개 유전자 표현이 머리 세포 생존, 죽음, 그리고 중생의 중재자로서 세포를 지원하는 역할을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

프로토콜

1. Utricle의 해부와 문화

  1. 승인된 프로토콜과 목을 벨을 사용하는 성인 (4 세 주 이상) 마우스를 안락사.
  2. 머리 양쪽에 외부 유스 타키 오관을 자르지하고 코를 향해 전진 피부를 당기십시오. 뒤에서 앞으로 머리를 이등분하고 골질 미로를 표시하는 방법으로 양측의 두뇌를 제거합니다.
  3. 멀리 뼈다귀 달팽이관에서 두개골을 손질하고 해부 현미경을 갖춘 조직 문화 후드에 골질 미로를 (bulla 포함) 전송 (참고 : 아데노 바이러스 작업 클래스 II 생물 학적 안전 캐비닛에서 수행되어야한다).
  4. 후드에서 멸균 해부 미디어를 포함하는 35mm 조직 배양 접시 (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (그림 1A) 각 달팽이관을 전송.
  5. 청각 bulla가 여전히 그대로있다면 (그것은 bulla과 정점 사이에 작은 이미지를 삽입하여 총 해부 동안 bulla를 제거하는 것이 가능달팽이관)는 bulla를 (그림 1B) 부수 (하나 # 3와 하나 # 5) 2 포셉을 사용합니다.
  6. 꼭대기,베이스, ossicles, 타원형 및 원형 창문 VIIIth의 신경 뿌리, 반원의 운하 (그림 1 C, D) : 골질 달팽이관 준비의 랜드마크를 식별합니다.
  7. 타원형 및 원형 창문 꼭대기는 접시와 VIIIth 신경 뿌리의 하단에있는 그러한가 직면하고, 위로 향하게 중간 측면과 함께 접시에 내이 (内耳)를 놓습니다. 반원의 운하 (그림 1D)의 지역에서 # 3 집게를 사용하여 준비를 잡아.
  8. # 11 칼날이 장착된 메스를 사용하여 신경 루트 (그림 1D)에 바로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기를 잘라.
  9. 절단 부분이 위로 향하게되어 있도록 준비를 켭니다. 준비 (그림 1E)를 안정화하기 위해 핸들로서 앞부분은 반원의 운하를 사용하십시오.
  10. # 5 포셉 사용하여 아래 modiolus에서 달팽이관을 제거기지. 달팽이관의 후크 영역이 아래로 밝혀졌 시점에서, saccule을 드러낸 뼈의 나선 얇은 판 (그림 1 층)의 마지막 골질 선반을 드는데 (깨진 # 55 포셉의 절반) 미세 탐침을 사용합니다. 그냥 saccule 아래에 중요 상징입니다 등골의 footplate입니다. utricle는 등골에 footplate (그림 1G)에 바로 인접해 있으며, 그것은 뼈로 둘러싸여 있습니다. 멀리 utricle의 1 / 3에 대해 밝히지만큼 뼈 칩에 탐침을 사용하십시오. 조심스럽게 # 55 포셉 (그림 1H)를 사용 utricle를 제거합니다. utricle가 골질 준비에서 가져온되기 때문에이 절차는 일반적으로 색소 지붕 상피의 제거집니다. utricle가 그대로 지붕 상피로 제거하는 경우 다만, 지붕은 # 55 포셉를 사용하여 제거할 수 있습니다.
  11. 아데노 바이러스 감염 Utricles (또는 라이브 이미징 실험)를 해부 (사전 감염까지) 동안 제거 otoconia 있어야합니다.이 경우에는 해부 미디어 가득한과 편협한 바늘 (보통 26-28 게이지)가 장착되어 있습니다 luer 잠금 주사기를 사용합니다. # 55 포셉 (그림 1I)을 사용하여 가장자리 utricle 잡아. 아래로 가리키는 바늘의 베벨과 utricle 가까운 바늘 팁을 가져와. 미디어 otoconia를 (그림 1J) 날린 해부의 스트림을 사용합니다. 또는 otoconia는 속눈썹 도구 (테드 펠라 주식 # 113)을 사용하여 그들을 솔질하여 제거할 수 있습니다. adenoviral 감염을 받아야 할 수 없습니다 Utricles 그대로 otoconia (쉽게 사후 수정 otoconia 제거를 위해 아래 참조)과 함께 24 잘 조직 배양 플레이트에 정상적으로 자유 부동 교양입니다.
  12. 모든 utricles가를 해부하고 나면 멸균 문화 미디어로 해부 미디어를 변경 DMEM F12은 (Gibco # 11320) 5% FBS 및 50 U / ML 페니실린 G (시그마)로 보충.
  13. Utricles는 37 ° C 5 % CO 2에서 배양해 있습니다. 문화 mainta 될 경우이상 48 시간 ined, 문화 미디어의 절반은 매일 변경해야합니다. 문화가 일주일 이상 지속됩니다.

2. 지원 셀의 아데노 바이러스 감염

중요 : 아데노 바이러스로 작업하는 것은 Biosafety 레벨 2 (BSL2) 절차 및 인증이 필요합니다. 지도와 BSL2 절차에 대한 교육에 대한 기관 Biosafety 담당관에게 문의하십시오.

  1. (아무 혈청) 위의 해부 미디어의 utricles 해부. 위와 같이 otoconia를 제거합니다.
  2. 감염 준비가되면 각각의 잘으로 한 utricle (세포까지)를 전송 Nunc 15 μL 혈청이없는 DMEM F12을 (혈청 바이러스를 inactivate 수 있기 때문에 이것은 중요하다)이 포함된 미니 트레이 (피셔 # 12-565-68) . 이 전송은 1.5 mm microcurette (# 10082-1​​5 파인 과학 도구에서)와 쉽습니다.
  3. 우리 AD-GFP 삭제 바이러스 E1 및 E3 유전자와 transg 운전 인간 CMV 프로 모터와 혈청형 5에너지 (GFP). 이 바이러스 벡터 BioLabs (필라델피아, PA로부터 얻은 것입니다 vectorbiolabs.com ). 주식 바이러스는 1.0-4.0 × 10 10 PFU / ML의 titers에서 제공합니다. 잘 utricle (그림 1L)를 포함하는 각 주식 바이러스 0.5-2 μl를 추가합니다. 사용되는 실제 금액은 바이러스와 주식 titer에 따라 다릅니다. 우리는 보통 1.0-4.0 × 10 7 PFU 각 utricle를 감염.
  4. 문화 utricles 바이러스가 들어있는 37에서 미디어를 ° C / 5 % 2 시간 동안 CO 2. 2 시간 후에, 혈청과 문화 미디어를 포함하는 24 잘 조직 배양 플레이트로 다시 utricles을 전송. 37 ° C / 5% CO 2에서 하룻밤 문화 utricles.
  5. Utricles는 라이브 이미징 실험 다음날 사용될 수도 있고, 그들은 (아래) 헤어 세포 immunochemistry에 대해 해결할 수 있습니다. transgene 발현 24 시간 이후 감염에 낮으면 시간이 지남에 따라 바이러스성 transgene 발현 증가는, 그래서 수 있습니다혈청 함유 미디어 추가 24시간 문화 세포의 유익. 네가 머리 세포 독성을 보게되면, 사용된 바이러스의 양을 줄일 수 있습니다.

3. Utricle 고정, Otoconia 제거 및 Immunochemistry

  1. 문화 시대 말기에, 적당한 온도에서 3시간 하나를 4 % paraformaldehyde에 utricles를 수정 (락 플랫폼에서) 또는 4에서 하룻밤 ° C. 0.1 M (1X) 소렌슨의 인산 버퍼 산도 7.4의 워시 제품 utricles (3 회, 15 분 각각). 이러한 단계는 24 잘 조직 배양 플레이트에 수행됩니다.
  2. Otoconia 제거 : 참고 : Otoconia은 (단계 위의 1.11 참조) 아데노 바이러스 감염하기 전에 제거해야합니다. 그러나, 감염 수 없습니다 utricles는 여전히 그대로 otoconia 함께 배양해하고 해결할 수 있습니다. 이 경우 고정 후 otoconia를 제거하려면 여기에 설명된 단계를 사용하십시오. 모든 남아있는 색소 지붕의 상피에 대한 utricles을 검사합니다. 조심스럽게 두 명이 # 55 f를 사용하여 남아있는 지붕의 상피를 제거orceps. otoconia를 제거하려면 750-1000 μl 칼 - 예 decalcifier (피셔 # CS510-1D)와 소렌슨의 인산 버퍼를 교체하십시오. 일분 40 초 (2 분 초과하지 않는)에 utricles에 칼 - 예 둡니다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 및 세척 (5 회, 5 분마다)와 칼 - 예를 교체하십시오.
  3. 10 분 동안 나트륨 borohydride에 utricles을 (시그마 # 452882, 탈이온수 1 %) 품다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 (5 회, 5 분마다)에 utricles 씻으십시오.
  4. 솔루션을 차단 관련 플레이스 utricles (PBS + 2% 소 혈청 알부민 + 0.8 % 정상 염소 혈청 + 0.4 % 트리톤 X-100) 락 플랫폼에서 실온에서 3 시간 동안.
  5. 일차 항체를 추가하고 4에서 하룻밤 품어 ° C. 솔루션 라벨 모두에게 세포를 차단에서 1:100에서 안티 - 마이 오신 7A (프로 테우스 중 Biosciences 발달 연구 하이 브리 도마 은행의 # 25-6790 또는 # MYO7A 138-1). 별도 striolar 및 비 striolar 세포 레이블을 지정하기 위해 이중 라벨 protoco을 사용한그리고 polyclonal 안티 calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, 미국, 1:200), 단클론 항 calmodulin (1:150 시그마 C # 3545)와구나. 이차 항체는 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국에서 보통 알렉사 형석 복합 이차 항체) 솔루션을 차단에서 1:500 희석하고 요동 플랫폼에서 상온에서 어둠 속에서 4 시간 동안 incubated됩니다.
  6. Fluoromount-G을 (남부 생명 공학, 버밍엄, AL, 미국)를 사용하여 유리 슬라이드에 마운트 utricles.

4. 대표 결과

이 방법은 전체 유지 사용 배양해 Utricles하면 세포와지지 세포 (그림 2) 모두에 대해 보완합니다. 건강한 문화 헤어드라 전지 7A - 긍정 마이 오신되는 얇은 세포질 지역으로 둘러싸인 둥근 핵 프로파일을 표시합니다 (그림 2, 상단 패널). 지원 전지 (안티 Sox2으로 표시) 작은 더 밀도가 높은 세포 (그림 2, 하단 패널)보다 포장. ADEnovirus는 utricle에서 지원하는 세포의 25-50%를 감염하고, 어떤 세포는 (그림 2, AD-GFP 패널)에 감염되지 않습니다. 그것은 바이러스 titer가 너무 높은 경우 머리카락 세포 사망이 가능하므로 각 아데노 바이러스의 최적의 작업 titer가, 경험적으로 결정되어야함을 지적한다. 또한, 기계적 손상 (절개 중에 발생한)의 지역은 바이러스의 대량 소요됩니다. 기계적 손상이 지역은 GFP 발현 및 누락 세포 중 매우 높은 수준으로 세포의 지속적인 라인을 통해 쉽게 구별할 수 있습니다. 이것은 손상되지 않은 문화의 세포 (그림 2) 지원에 흩어진 GFP 발현와는 대조적이다.

figure-protocol-1
1 그림. 절개를 Utricle. :. 청각 bulla (AB) B :. bulla 두 튼튼한 집게를 사용하여 깨지는 경우 C : 나폴레옹 달팽이관 (RW = 둥근 창, S =. stapedial 동맥, C = 달팽이관, ST = 등골) D :.. 메스 블레이드 (SB)를 VIIIth 뇌신경 (8 일 N) ASC = 앞부분은 반원의 운하를 이메일로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기을 차단하는 데 사용됩니다 : 준비는 가장 바깥쪽 뼈 (화살표)의 앞부분은 반원의 운하 (ASC)와 다른에 삽입 하나 포크로 # 3 집게를 사용하여 단단히 개최됩니다. 막의 미로는 집게를 사용하여 제거됩니다 F는 :. 막의 미로는 제거를 통해 뼈의 나선 얇은 판의 기저 차례 후크 지역 근처에서 볼 수 있습니다. 미세 프로브 선반을 세운 자세하고 (화살표)를 제거하려면이 골질 선반 아래에 삽입되는 G는 :. saccule을 제거 후, utricle (U)은 등골에 footplate (SF)에 바로 인접 볼 H :. Utricle는 (U ) # 55 포셉 (화살표)를 사용하여 제거됩니다 SF = 등골의 footplate는 I :.. otoconia과 Utricle (O) 부분 삭제D 감각 상피 (SE) 표시 아래는 J :. Otoconia (O)는 26 게이지 바늘로 장착되어 주사기에 의해 전달되는 미디어 스트림을 사용하여 utricle에서 제거됩니다. 바늘 (S)의 그림자 이미지의 하단에 표시됩니다 K :.. Adenoviral 감염 : Utricle은 otoconia 제거하고 감각 상피 (SE) 볼 L 각 utricle (U)가 미니를 잘 개인에 배치됩니다 - 트레이. 지원 세포가 잘 (P는 = Pipet 팁)에 바이러스를 pipetting하여 아데노 바이러스에 감염됩니다.

figure-protocol-2
그림 2. 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염. Utricles는 녹색 형광 단백질의 아데노 운전 표현 (AD-GFP)에 감염되었다. 헤어 셀 층 한 utricle 같은 지역에서 지원하는 세포 계층의 공촛점 이미지가 표시됩니다. 모발 세포는 마이 오신의 7A에 대해 항체로 분류하고 있습니다(마젠타). 지원 전지 Sox2 (적색)에 대한 항체로 분류하고 있습니다. 개략도 utricle 감각 상피와 세포의 위치 (HC) 및 지원 세포 (SC)의 구조를 보여줍니다. (U) 위턱과 아래턱에 표시된 공촛점 (광) 섹션의 위치는 (L) 패널은 배선의 점선 라인으로 표시됩니다. 어퍼 패널 : 머리카락 세포 핵의 수준에서 찍은 공촛점 이미지에서, AD-GFP 신호가 세포 사이의 공간에 나타나고 머리카락 세포 마커 마이 오신의 7A와 중복되지 않습니다. 로어 패널 : 지원하는 세포 핵의 수준에서 공촛점 섹션에서 광고-GFP 신호가 지원하는 세포 마커 삭스-2와 colocalizes. 셀만을 지원 GFP 발현 및 머리카락 세포의 AD-GFP 감염 결과는 감염됩니다.

figure-protocol-3
그림 3. Adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포의 죽음을 초래하지 않습니다. UT는ricles은 4 × 10 8 PFU / ML에서 AD-GFP에 감염되었다. Utricles는 마이 오신의 7A (헤어 세포 마커)와 Sox2 (세포 마커를 지원하는)에 대한 항체로 분류되었다. 헤어 셀 및 지원 셀 카운트는 제어 utricles 및 광고-GFP 감염 utricles위한 있었 읍니다.

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토론

감각 세포는 노화, 소음 외상, 그리고 aminoglycoside의 항생제와 antineoplastic 에이전트 cisplatin을 포함 ototoxic 약물에 대한 노출을 포함하여 스트레스의 다양한 의한 죽음에 감염될 수 있습니다. 영구적인 청력 손실 및 / 또는 균형 장애의 포유 동물 털 세포 사망 결과입니다. 체외 모델 시스템에서 세포와 분자 메커니즘 밑에있는 머리 세포 죽음뿐만 아니라, 머리카락 세포 사망을 방지하거나 반대를 대상으로 이러한 결정을 목표로 연구를위한 중요한 도구입니다 . 성인 포유류에서 달팽이 세포와는 달리, utricle의 세포는 문화에 잘 남아있다. Utricle 머리 전지는 노출에서 달팽이 세포에 독성이있는 동일한 치료 약물 및 ototoxic 헤어 세포 죽음과 생존 utricular와 달팽이 모두 세포 12-18위한 유사 근간 세포의 메커니즘에 대한 죽음에 민감합니다. 또한, 언제 utricle 모델 시스템에서 얻어진 데이터를 처리할 수 있습니다생체내에서...

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공개 사항

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

이 작품은 난청과 기타 통신 장애의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 추가 지원이 NIDCD 5R01 DC007613에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 회사 소개 카탈로그 번호
중형 199 Gibco / Invitrogen 12,350
DMEM/F12 Gibco / Invitrogen 11,320
파인 포셉 (# 55) 파인 과학 도구 11255-20
파인 포셉 (# 5) 파인 과학 도구 11252-30
포셉 (# 3) 파인 과학 도구 11231-30
페니실린 G 시그마 P3032
태아 소 혈청 Invitrogen 10082-1​​39
Nunc 미니 트레이 피셔 12-565-68
아데노 바이러스-GFP 벡터 Biolabs 1060 *
칼 - 전 decalcifier 피셔 CS510-1D
나트륨 borohydride 시그마 452,882
안티 - 마이 오신 7A (polyclonal) 프로 테우스 Biosciences 25-6790
안티 - 마이 오신 7A (단클론) 발달 연구 하이 브리 도마 은행 MYO7A 138-1
안티 Calmodulin 시그마 C 3545
안티 Calbindin Chemicon AB1778
Fluoromount G 남부 바이오 어소 시에이츠 0100-01

표 1. utricle 문화와 아데노 바이러스 감염에 사용되는 시약 및 도구.

*주의 : AD-GFP는 일반적으로 1x10의 주식 titer에서 벡터 Biolabs에 의해 제공됩니다 10 PFU / ML. 우리는 1.2 × 10의 titer에서 재고 바이러스를 제공하기 위해 사용자 정의 증폭을 요청 11 PFU / ML.

참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.

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