방법 논문

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

DOI:

10.3791/3760

2012년 4월 30일

이 논문에서

요약

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간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

초록

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거대한 노력은 쉬운 세포 조작을 허용 고전적인 2 차원 세포 배양 모델을 사용하여 많은이 작품의이 완료되어 정상 및 악성 세포 행동 1-2,,에 관련된 신호 전달 경로와 분자를 식별하고 있진 않지만. 그것은 세포 내 신호 전달 경로는 차원 및 3-4 세포 표면 장력을 포함한 세포외 세력에 의해 영향을받는 것이 분명되었다. 다중 접근 방식은 더 정확하게 생물 학적 조직 구조 3 대표하는 입체적인 모델을 개발하기 위해 촬영되었습니다. 이러한 모델은 다중 차원 건축 스트레스를 통합할 수 있지만, 세포의 논리상 필연의 효과 연구 모형의 한계 및 후속 분석을 위해 세포를 추출의 어려움으로 인해 2 차원 조직 배양에보다 쉽게​​ 이해되는 것입니다.

tumorigenesis 및 종양 행동 종양 주위 microenvironment의 중요한 역할 I의 점점 4 인정되고. 종양 기질은 여러 세포 유형 및 세포 분자로 구성되어 있습니다. 종양이 개발 중에 종양 세포 stromal 세포 5 사이의 양방향 신호가 없습니다. 종양 - 기질 공동 진화에 참여하는 몇 가지 요소가 확인되어 있지만, 체계적으로 파악하고 이러한 신호 6 전체 배열을 공부하는 간단한 기술을 개발할 필요가 여전히있다. 섬유아 세포는 정상이나 종양 - 관련 stromal 조직에서 가장 풍부한 셀 타입이며, 증착 및 지하 막과 paracrine 성장 요인 7의 유지에 기여한다.

많은 그룹은 종양 치료에 대한 반응, 면역 세포의 채용, 신호 전달 분자, 증식, apoptosis, angiogenesis, 그리고 침공 8-15 등 다양한 세포 기능에 섬유아 세포의 역할을 공부하고 입체 문화 시스템을 사용해 왔습니다. 우리는 엉덩이에 대한 간단한 방법을 최적화했습니다혼합 세포 인구 (공동 문화) 16-22의 입체 문화를 만드는 상용 세포외 매트릭스 모델을 사용 mammary 상피 세포에 mammary 섬유아 세포의 효과를 essing. 지속적인 공동 문화와 세포 내부에있는 섬유아 세포 클러스터링과 크게 spheroids의 외관에와 매트릭스로 멀티 셀룰러 전망을 형성 상피 세포와 spheroids를 형성하고 있습니다. 변경된 상피 세포 invasiveness로 연결 섬유아 세포의 조작이 쉽게 숫자와 상피 전망 23 길이의 변화에 의해 계량하실 수 있습니다. 더욱이, 우리는 상피 행위에 대한 fibroblast 노출의 효과 분석을 용이하게 입체 공동 문화 상피 세포를 분리하는 방법을 고안했습니다. 우리는 공동 문화의 영향이 여러 assays를 수행하기 위해 충분한 시간을 허용, 상피 세포 격리 후 몇 주 동안 지속 것으로 나타났습니다. 이 방법의 세포에 대한 적응악성 잠재력을 변화하고하는 것은 전문적인 장비를 필요하지 않습니다. 이 기술은 여러 조건 하에서 체외 세포 모델의 급속한 평가를 허용하고, 해당 결과는 생체내 동물 조직 모델뿐만 아니라 인간의 조직 샘플에서 비교할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 입체 공동 문화 구축

  1. 공동 문화를 확립하기 전에 하루, 하룻밤은 4 ° C 냉장고에서 얼음 냉동실과 해동에서 Matrigel를 제거합니다.
  2. 10% 소 송아지 혈청, 5 μg / ML 인슐린과 DME/F12 매체 : 실험 당일 사용되는 상피 세포에 대한 매체 (이 예에서는 HMEC 중간에 해당하는 공동 문화를 위해 매체를 준비 , 1 μg / ML의 하이드로코티손, 1 NG / ML EGF). 이전 Matrigel과 믹싱까지 얼음으로 최소한 1 시간마다 매체를 보관하십시오.
  3. 해동 Matrigel을 희석하기 위해 Matrigel의 총 원하는 수량 결정 : 매체 (300 μL마다 잘 24 - 잘 접시) 및 얼음에 멸균 튜브에 얼음처럼 차가운 HMEC 매체의 절반 볼륨을 추가합니다. 그렇다면 1:1 희석을 달성하기 위해 튜브에 해동 Matrigel의 같은​​ 반 전체 볼륨을 추가합니다. 얼음 튜브를 유지.
  4. 장소 50 Matrigel의 μL : 24 - 잘 접시의 지정된 우물의 중간 중간 잘 혼합하고humidified 공기 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 10 분 동안 품어.
  5. 우물에 매체를 혼합하여 다른 60 분 품어 : Matrigel의 추가 450 μL를 추가합니다.

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토론

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여기에 제시된 방법은 종양 세포를 포함한 상피 세포에 stromal 섬유아 세포의 효과를 분석에 대한 간단한 접근 방식을 나타냅니다. 추가 분석을 위해 모체의 세포는 쉽게 추출을 가능하게하면서 그것은 세포외 지하 멤브레인 매트릭스에서 지원하는 입체적인 맥락 내에서 직접적인 세포 - 세포 상호 작용을 허용합니다. 이것은 fibroblast 라인은 선택과 상피 라인은 그림 1에서와 같이 침략 가능성에 따라 다를 수의 신호 전달 경로에 영향을 조절할 수로 종양 - 관련 기질 연구에 적용할 수 있습니다. 3 차원 공동 배양 모델은 세포 invasiveness의 변화가 유도되었다는 시각적인 검증을 허용합니다. 격리 프로토콜 처리의 최소 3D 문화의 세포의 추출을 허용하고 셀 속성에 영향을 미칠 수 트립신 또는 매트릭스 - 용해 대리인의 사용을 방지합니다. 공동 문화 3D의 fibroblast에 대한 노출의 효과 후미 상피 세포에서 지속이후 분석 결과 (그림 4)을 촉진 3D .......

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
BD Matrigel BD Biosciences 356,237 무료 페놀 - 레드
Hyclone 고전 액체 매체 : DMEM F12 ThermoScientific SH30023.01
Hyclone 소의 송아지 고기 세럼 ThermoScientific SH3007303
인슐린 EMD 화학 407,709 0.005N HCL에 디졸브, 0.22 μm의 필터
하이드로코티손 시그마 - 올드 리치 H4001 50% EtOH에 디졸브, 0.22 μm의 필터
EGF 시그마 - 올드 리치 E9644 10mM 초산에 용해, 필터는 0.22 μm의를

참고문헌

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  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  3. Kim, J. B.

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