방법 논문

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

DOI:

10.3791/3778

⸱

2012년 4월 9일

 ,  , 
1Department of Medicine, Section of Cardiology, St. John-Providence Health System, 2Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험적 면역 encephalomyelitis (EAE)은 중추 신경계 (CNS)의 염증성 질환이며, 인간의 demyelinating 질환, 다중 경화증 (MS)의 연구를위한 동물 모델로 사용되었습니다. EAE는 CNS에 mononuclear 세포의 pathologic 침투 의해 중풍 질병의 임상 발현이 특징입니다. 다른 강한 반면 MS와 마찬가지로, EAE 그 특정 마우스 종자에 유전자 통제 또한 질병 유도에 감염될 수 있습니다. 일반적으로, C57BL / 6 (H-2 b)는 쥐가 myelin 기본 단백질과 예방 접종 (MBP) 중풍 징후를 개발하기 위해 실패합니다. 여기에 설명된 실험 프로토콜이 C57BL / 6 마​​우스뿐만 아니라 다른 유명한 모성 마우스 종자에 심각한 EAE를 유도하는 데 사용되었던대로이 응답하지 않는 문제는 확실히 항원 처리 또는 MBP의 항원 프레 젠 테이션의 결함으로 인해하지 않습니다. 또한, C57BL / 6와 MBP에 대한 반응 Balb / C 마우스에서 encephalitogenic T 세포 클론은 성공이었다완전히 격리 및 전파.

실험 프로토콜 (200 μg / 마우스) MBP-중이오 C57BL / 6 기증자 림프절 세포가 격리되고 MBP-특정 T 세포의 수영장을 확장하기 위해 항원과 함께 5 일 동안 배양해있는 셀룰러 입양 전송 시스템을 사용하는 것입니다. 문화 시대 말기에 50,000,000 가능한 전지는 꼬리 정맥을 통해 순진 syngeneic 수신자로 전송됩니다. 그래서 일반적으로 치료받는 생쥐 따라서 그들의 저항 상태를 재확인, EAE를 개발하지 않으며, 그들은 무한정 정상 남아있을 수 있습니다. 열흘 포스트 셀 전송은받는 생쥐 전체 Freund 도움이되는 (CFA) - 유화 측면 네 개의 사이트에 MBP 맡고있다. 심한 EAE는 10-14일 도전 후이 생쥐로 개발하기 시작합니다. 결과는 관련이없는 항원과 도전이 질병의 임상 증상을 유발하지 않았다으로 질병의 유도는 antigenic의 구체적인 것을 보여주었다. 중요한 것은 항원 선량의 적정가로 사용되는도전받는 생쥐는 5 μg / 마우스처럼 낮은 될 수 있다고했다. 또한, antigenic의 도전의 타이밍의 운동 연구 질병을 유발하는 도전 5 일 게시물 antigenic 도전 및 445 일 포스트 antigenic 도전여 그 와중에 이르면 효과였다 보여주었다. 응답하지 않는 문제를 유지 "긴"T 세포 인구의 참여 향한 이러한 데이터는 강력하게 가리 킵니다. 이 시스템의 규제 T 세포 (Tregs)의 참여가 정의되지 않았습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. CFA-유화 항원을 준비

  1. 이 MG / ML의 농도에서 인산염 완충 용액 (PBS)에서 기니 피그 MBP를 (Swanborg1의 방법에 따라 준비와 4 ° C에서 동결 건조된 형태로 저장) 디졸브. 합성 MBP의 펩티드 (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR가) 2를 사용하는 경우 2 밀리그램 / ML 솔루션을 준비합니다. luer-lok과 유리 주사기로 항원 용액의 적당량 (마우스 당 0.1 ML 예방 접종을해야합니다)를 작성하다.
  2. luer-lok을 갖춘 또 다른 유리 주사기로 항원 용액과 동일 완료 Freund의 도움이되는 H37Ra (0.1WT %) (CFA, Difco 연구소)의 볼륨을 그립니다.
  3. 세 가지 모양의 꼭지와 두 개의 유리 주사기를 연결합니다. 앞뒤 plungers을 추진하여 CFA와 MBP 솔루션을 섞는다. 유제가 형성 될때까지 움직임을 유지.
  4. 유제가 형성되었는지 테스트하려면 하나의 주사기로 혼합물을 모두 밀어. 빈 주사기를 분리, T를 당겨그는 조금 뒤로 플런저하고 실온에서 깨끗한 물을 비커에 잔류 유제의 방울 방전. 유제 떨어지는 물의 표면에 그대로 남아있을 경우 에멀젼이 형성된다. 유제 드롭 분광 경우, 주사기를 다시 연결하고 혼합 움직임을 계속합니다.
  5. 항원의 정확한 복용량의 전달을 보장하기 위해 예방 접종 과정 1 ML 플라스틱 주사기를 사용하십시오. 플라스틱 주사기로 항원 유제를 전송하려면, 플런저를 꺼내하고 이전 유리 주사기는 1.4으로 연결이 끊어졌습니다 세 방향 꼭지의 개통으로 빈 플라스틱 주사기를 삽입합니다.
  6. 유리 주사기의 플런저를 밀어 가장자리에 플라스틱 주사기를 채우십시오. 다시 플라스틱 주사기의 플런저를 넣고 플라스틱 주사기에 1.2 ML 점수에 도달까지 돌려 초과 유제를 밀어. 이 책략은 공기 방울은 플라스틱 주사기 안에 갇혀되지 않도록 보장합니다.
  7. 세 가지 모양의 꼭지에서 플라스틱 주사기를 제거합니다. 아타플라스틱 주사기로 # 26 게이지 바늘 채널. 유제 이제 바늘의 공극 볼륨을 채우고 있도록 한 ML 표시로 플런저를 민다.

2. 공여 마우스의 예방 접종

참고 : 여성 C57BL / 6 마우스는 일반적으로 원래 국립 보건원에서 McFarlin 조 3 설계 방법에 따라, 측면 네 개의 사이트에 항원 유제로 주입된다. 경험 조사의 경우 한 사람이 모든 작업을 수행할 수 있습니다. 초보자를위한 도움은 한 사람이 마우스를 가지고 있으며 다른 사람이 주사를하지 않도록 청한 수 있습니다. 또는, 마우스는 주사에 대한 anesthetized 될 수 있습니다.

  1. 목 피부로 단단히 마우스를 누른 상태 흉부와 복부에 쉽게 액세스할 수 있도록 4 번째와 5 번째 손가락 사이에 꼬리를 다시 누르고 있습니다.
  2. (MO의 약간 오른쪽 겨드랑이 위의 흉부의 사이트에 1mL 플라스틱 주사기의 바늘을 놓으십시오사용) 및 subcutaneously 항원 유제의 0.05 ML 투입. 약간 흰 CFA의 약간 불룩한는 창백한 피부를 통해서도 볼 수있다. 약간 왼쪽 겨드랑이 위의 흉부의 사이트에 대해 동일한 단계를 반복합니다.
  3. 꼬리를 풀어과 오른발 (마우스)으로 잡아 그것을 설정하고 4 번째와 5 번째 손가락 사이를 개최. 오른쪽 측면에서 단지 늑골 케이스 아래 사이트를 찾아 항원 유제의 0.05 ML 투입.
  4. 오른발을 풀어, 마우스에게 다른 방법으로 돌아서 4 번째와 5 번째 손가락 사이 왼발을 (마우스) 누르고 있습니다. 왼쪽 측면에서 단지 늑골 케이스 아래 사이트를 찾아 항원 유제의 0.05 ML 투입.
  5. 10 생쥐의 주입 후 신선한 바늘로 변경, 또는 바늘이된다 면요 dulled.

3. 7 ~ 10 일 예방 접종 후 조직 배양을위한 림프절 전지의 분리

  1. 7-10 일 예방 접종 후 생쥐를 희생그리고 배수 림프절을 제거합니다. 안락사의 선호하는 방법은 CO 2 흡입하는 것입니다. 팔다리가 뻗어와 핀으로 보드에 고정으로 희생 후 절개 보드에 그 뒷면에 마우스를 바칩니다. 생쥐는 70 %의 에탄올을 스프레이로 침수된다.
  2. 최대 멸균 가위와 집게와 턱까지 복부의 아래쪽 끝에서 중앙에 길이 방향 피부에 슬릿을 잘라요.
  3. 각 다리 아래로 사타구니의 영역에서 복부 피부를 잘라. 뒤로 사타구니 림프절을 노출, 피부 파악 껍질.
  4. 피부가 벗겨과 겨드랑이 근처의 겨드랑 림프절을 폭로 넘어뜨린 수 있도록 앞발이 (왼쪽과 오른쪽)을 따라 피부를 잘라.
  5. 함께 일하는 포셉의 이쌍로 덮고 결합 조직을 끌어낼과 사타구니의 림프절 주위. 결합 조직이 해제되면 림프절 미만 포셉 한 쌍을 배치하고 몸에서 멀리 당기십시오. 를 삽입35mm 배양 접시에있는 임파선은 멸균 PBS로 가득.
  6. 이쌍 포셉의를 사용하여 두 겨드랑의 림프절을 덮고있는 결합 조직을 멀리 당겨. 림프절 격리하고 배양 접시에 넣어. 출혈이 매우 어려운 림프절을 식별 만들면서 영역을 넘어 혈관을 아프게하지 않도록 매우주의하십시오.
  7. 모든 림프절을 수집한 후, biosafety 후드에 페트리 접시를 이동합니다. 흩어져 및 기타에 대해 하나를 연삭, 포셉의 이쌍 함께 떨어져 림프절을 애타게. 또는 임파선이 배양 접시의 바닥에있는 림프절에 대해 누르면 3 ML 플라스틱 주사기의 플런저의 평평한 끝을 사용하여 헤어 졌 수 있습니다.
  8. 세포막과 파편을 제거하는 나일론 메쉬를 통해 조롱 림프절의 세포 현탁액을 전달합니다.
  9. 림프절의 세포 현탁액 멸균 PBS를 사용하여 50 ML까지를 확인하십시오. 10 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기. 문화 매체에 펠렛을 Resuspend. 가능한 C를 수행엘자는 4 X 10 6 세포 / ML로 농도를 계산하고 조정합니다. UseRPMI 1,640 10 % 태아 송아지 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, 1 밀리미터 MEM 나트륨 pyruvate, 0.1 MM MEM 비 필수 아미노산, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 MM Hepes 버퍼와 5 X와 보충 10 -5 M 2 - 나. 세포를 resuspending 전에 미리 따뜻한 문화.
  10. 물론 당 2 ML 볼륨 (최종 세포 농도를 8 X 10 6 세포 / 음) 24 잘 배양 접시의 문화가 세포. 100 μg / ML의 최종 농도에서 각도에 항원을 추가합니다. 5% CO 2와 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. 5 일째 세포를 품어.

4. 5 일 문화의 준비 시작 이후 교양 림프절 세포를 수확

  1. 파스퇴르 유리 피펫이나 작은 볼륨 피펫와 함께 아래로 최대 pipetting하여 각 우물에 세포를 섞습니다. 50 ML의 원심 튜브에 세포를 수확.
  2. 10 분 1,000 rpm으로 세포를 원심 분리기. ResusPBS의 작은 볼륨으로 세포 펠렛을 pend.
  3. 세포를 세고 멸균 PBS와 2.5 X 10 8 셀 / ML로 실행 가능한 세포 농도를 조정합니다. # 26 게이지 바늘로 장착되어 주사기로 세포를 그립니다.
  4. 꼬리 정맥을 치료하는 데 도움받는 생쥐의 새장 이상 가열 램프를 놓습니다.
  5. 마우스 홀더를 사용하여, 홀더에 슬릿을 통해 마우스의 꼬리를 확장합니다. 꼬리를 확장 당기세요. 정맥을 찾습니다.
  6. 5 X 10 7 세포를 동등해지기, 세포 현탁액의 0.2 ML / 마우스를 주사.

5. 받는 마우스의 Antigenic 챌린지 20 일 포스트 셀 전송 및 질병 증상의 개발

  1. 도전받는 마우스 항원과 질병의 징후를 보여주는 없습니다. 절차는 "기증 마우스의 예방 접종"에 대한 섹션 2와 동일합니다.
  2. 7~10일 antigenic 도전 이후 중풍 질환의 개발을 관찰.
    1. 질병은 꼬리에 약점으로 시작합니다. 질병은 1로 등급이있다꼬리는 이완된되면. 마우스를 한 뒷다리에 마비가되었을 때 질병은 2로 등급이있다. 질병은 모두 두 다리가 마비되면 3 등급 앞으로 크롤링할 때 마우스 모두 두 다리를 끌 수 있습니다. 마우스 마우스가 완전히 고정되어 떠나, 두 앞발의 사용을 잃게되면 질병은 4 등급된다. 마우스가 죽어가는이며 신체가 곱슬머리 때 질병은 5 등급있다. 죽음은 질병 학년 6 4로 채점된다.
  3. 이 프로토콜에 따라 C57BL / 6 마​​우스에서 유도된 MBP 특정 EAE는 monophasic입니다. 생쥐는 질병으로부터 회복 수도 있지만 자발 relapses을 받아야하지 않습니다.

6. 대표 결과

받은 마우스는 대기 중이오 체외 - 확장된 기증자 림프절 세포에 질병 유도에 그들의 저항을 반영 EAE 질병 증상을 개발하지 않았다. 그러나, 심각한 질병은 antigenic 도전의 능력을 보여주는, antigenic 도전 (표 I) 후 개발저항 메커니즘을 되돌리는 인치 지적 antigenic 도전의 두 특수 기능은 항원의 접종과 질병을 유발하는 도전의 운동이 있습니다. 표 III와 같이 항원의 매우 낮은 복용량이 필요합니다. 항원 (표 IV)에 도전했을 때 놀랍게도, 올해 기증자 세포를받은 생쥐는 여전히 심각한 질병을 개발할 수 있습니다. 이 두 관측 강력히 EAE 저항을 유지하는 "긴"T 세포의 참여를 제안합니다. 이 프로토콜은 많은 EAE 모성 마우스 종자 4 ~ 적용됩니다.

figure-protocol-1
평판이 강한 마우스 종자의 EAE의 유도를위한 실험 설계의 그림 1. 플로우 차트.

임상 EAE
입양 전송 후 		임상 EAE
antigenic 도전 후
변형 항원 투사 AV. 질병 학년
(범위) 		AV. 발병의 일
(범위) 		투사 AV. 질병 학년
(범위) 		AV. 발병의 일
(범위)
SJL MBP 21분의 21 4.0 (3-5) 8.0 (6-10) ND ND ND
C57BL / 6 MBP 0 / 10 - - 7분의 7 3.85 (3-5) 9.28 (9-10)
Balb / C MBP 0 / 7 - - 5분의 5 3.2 (3-4) 7.0 (7)
C3H/HeJ MBP 0 / 7 - - 4분의 4 3.2 (3-4) 8.0 (8)
C57BL / 6 MBP 60-80 0 / 4 - - 4분의 4 2.75 (2-4) 10.2 (9-11)

표 나. MBP-매개 C57BL에서 EAE / 6 생쥐의 유도. C57Bl / 6 생쥐에서 대기 중이오 체외 - 확장된 공여 세포로 유도 않았 EAE의 입양 전송됩니다. Antigenic의 도전 포스트 셀 전송 질병 유도에 감염될 쥐를 렌더링. AV., 평균. ND는 끝나지 않았어.

antigenic 도전 후에 임상 EAE
마중물 항원 도전 항원 투사 AV. 질병 학년
(범위)		 AV. 발병의 일
(범위)
MBP-CFA CFA 혼자 0 / 3 - -
MBP-CFA OVA-CFA 0 / 3 - -
MBP-CFA MBP-CFA 3분의 3 4.0 (4.0) 7.7 (7-9)

antigenic의 도전 표 II. 특이성. 받는 생쥐 마중물 항원뿐만 아니라 다른 관련없는 항원에 도전했다. 오직 마중물 항원은 심각한 질병을 유도. OVA : 닭고기 ovalbumin. AV., 평균.

antigenic 도전 후에 임상 EAE
도전 항원 접종 (μg / 마우스) 투사 AV. 질병 학년
(범위) 		AV. 발병의 일
(범위)
200 4분의 4 3.75 (3-4) 8.25 (7-9)
100 4분의 4 3.67 (3-4) 7.5 (7-8)
50 4분의 4 3.25 (3-4) 8.25 (7-10)
25 4분의 4 3.0 (3.0) 8.25 (8-9)
10 4분의 4 3.0 (3.0) 8.76 (8-9)
5 4분의 4 2.5 (2-3) 9.75 (9-10)
일 4분의 2 1.0 (1.0) 16 (14-18)
0 0 / 4 - -

표 III. 도전 항원 접종은 질병 유도를 위해 필요합니다. 받는 생쥐에 도전하는 데 사용 MBP의 다양한 농도가 테스트되었습니다. AV., 평균.

antigenic 도전 후에 임상 EAE
도전 항원 도전의 날 투사 AV. 질병 학년
(범위) 		AV. 발병의 날
(범위)
MBP-CFA 5 4분의 3 1.33 (1-2) 9.67 (9-10)
MBP-CFA 10 4분의 4 3.0 (3.0) 8.25 (7-9)
MBP-CFA 15 4분의 4 3.75 (3-4) 7.25 (7-8)
MBP-CFA 25 4분의 4 4.0 (4.0) 8.0 (7-9)
MBP-CFA 35 4분의 4 3.5 (3-4) 7.5 (7-8)
MBP-CFA 60 4분의 4 3.75 (3-4) 9.0 (8-10)
--------------------------
MBP-CFA 343 3분의 3 3.0 (3.0) 10.33 (10-11)
MBP-CFA 445 3분의 3 3.0 (3.0) 7.0 (7.0)

antigenic 도전의 표 IV. 속도론. 받는 생쥐 채택 다양한 시점 포스트에 도전했다필자 셀 부가됩니다. AV., 평균.

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토론

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생쥐에서 EAE의 연구는 종종 neuroantigens, myelin 기본 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP) 또는 myelin oligodendrocyte 단백질 (소)를 사용합니다. 이전 연구는 주로 MBP를 사용했습니다. PLP는 SJL 생쥐에서 강력하고 일관된 반응을 자극. B6 생쥐가이 항원과 질병 유도에 감염될 때문에 최근에는 집고 양이가 사용되는 일반적인 neuroantigen입니다. 유전자 타겟 마우스 종자의 대부분은 B6 유전 배경에 있습니다. 흥미롭게도, B6 생쥐는 집고 양이와 함께 유도를 EAE하기 쉽습이지만 MBP와 질병 유도에 강한 있습니다.

대부분 질병의 유도 메커니즘, 규제 T 세포 5-7 의한 시토킨 생산과 복구 중재의 효과를 중심으로 EAE의 메커니즘을 elucidating의 이전 노력. 유명한 EAE 강한 쥐가 반면에 질병의 유도를 파괴 수있는 방법, 광범위하게 조사되지 않았다. 이것은 u를 quan...

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감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

국립 보건원에서 보조금 (R01 NS37253와 N01 NS055167)과 국립 다중 경화증 협회 (RG 3288-A6)에 의해 부분적으로 지원.

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재료

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기니 돼지 척수 코드 록클랜드 Immuno - 화학 주식 회사
Gilbertsville, PA 19525
www.rockland-inc.com 		GP-T065 냉동
Freund의 도움이되는 완벽한 H37Ra Difco Laboratories의
디트로이트, MI 		231,131
Multifit 교환 가능한 주사기 BD
www.bd.com / 우리 		512,133
RPMI 1640 Mediatech주식 회사
매나 사스, VA
www.cellgro.com 		10-040-CM
OVA 시그마 - 올드 리치
www.sigmaaldrich.com 		A5503
마우스 잭슨 연구소
바 하버, 메인 		B6 생쥐 : 0,000,664

참고문헌

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