Method Article

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

DOI:

10.3791/3791

⸱

May 4th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는 특정 단백질의 당화(glycosylation) 프로파일링을 가능하게 하는 글라이칸 결합 단백질 검출을 통해 다중화된 고처리량 항체 마이크로어레이에 사용하기 위한 효과적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 단백질의 당화(glycosylation)는 단백질에서 발견되는 가장 흔한 번역 후 변형(post-translational modification)이며, 단백질의 물리적, 화학적, 생물학적 특성의 다양한 변형을 유도합니다. 당화(glycosylation) 기전은 질병 진행과 악성 변형에 특히 취약하기 때문에 비정상적인 당화(glycosylation)는 암 및 기타 질병에 대한 조기 발견 바이오마커로 인식되어 왔습니다. 그러나 단백질 당화(glycosylation)를 연구하는 현재의 방법은 일반적으로 대부분의 일반 실험실 또는 임상 환경에서 사용하기에는 너무 복잡하거나 비용이 많이 들며 단백질 당화(glycosylation)를 연구하기 위한 보다 실용적인 방법이 필요합니다. 이 연구에서 설명한 새로운 프로토콜은 글리칸 결합 단백질(GBP) 검출과 함께 화학적으로 차단된 항체 마이크로어레이를 사용하고 단백질 당화(glycosylation)를 연구하는 데 필요한 시간, 비용 및 실험실 장비 요구 사항을 크게 줄입니다. 이 방법에서는 여러 개의 고정된 당단백질 특이적 항체가 마이크로어레이 슬라이드에 직접 인쇄되고 항체의 N-글리칸이 차단됩니다. 차단되고 고정되지 않은 당단백질 특이적 항체는 마이크로어레이 슬라이드에 직접 적용되는 복잡한 샘플에서 당단백질을 포착하고 분리할 수 있습니다. 그런 다음 비오틴화된 렉틴 및 기타 GBP를 마이크로어레이 슬라이드에 적용하여 글라이칸 검출을 수행할 수 있으며, 결합 수준은 Dylight 549-Streptavidin을 사용하여 측정할 수 있습니다. 항체 패널을 사용하고 여러 비오틴화 렉틴을 사용한 프로빙을 통해 이 방법을 사용하면 주어진 인간 또는 동물 샘플에서 발견되는 다양한 단백질의 효과적인 당화(glycosylation) 프로파일을 개발할 수 있습니다.

소개

단백질의 당화(glycosylation)는 단백질에 대한 가장 흔한 번역 후 변형으로, 단백질의 물리적, 화학적, 생물학적 특성을 변형하고 다양한 생물학적 과정1-6에서 근본적인 역할을 합니다. 당화(glycosylation) 기전은 질병 진행과 악성 변형에 특히 취약하기 때문에 비정상적인 당화(glycosylation)는 암 및 기타 질병에 대한 조기 발견 바이오마커로 인식되어 왔다 7-12. 실제로, 간세포 암종 13-15에 대한 α-1 태아단백(AFP)의 L3 분획 및 췌장암 16, 17에 대한 CA199와 같은 대부분의 최신 암 바이오마커는 모두 당단백질의 비정상적인 글라이칸 부분이다. 그러나 단백질 당화(glycosylation)를 연구하는 방법은 복잡하며 일상적인 실험실 및 임상 환경에는 적합하지 않습니다. Chen 등은 최근 복잡한 샘플에서 천연 당단백질의 고처리량 및 다중 프로필 당화(glycosylation)를 위한 글라이칸 결합 단백질(GBP) 검출 방법을 사용하여 화학적으로 차단된 항체 마이크로어레이를 발명했습니다 18. 이 친화력 기반 마이크로어레이 방법에서는 여러 개의 고정된 당단백질 특이적 항체가 마이크로어레이 슬라이드에서 직접 복합 혼합물로부터 당단백질을 포획하고 분리하며, 포획된 각 단백질의 글라이칸은 GBP로 측정됩니다. 모든 정상 항체에는 대부분의 GBP에서 인식할 수 있는 N-글라이칸이 포함되어 있기 때문에 이 방법의 중요한 단계는 항체의 글라이칸이 GBP에 결합하는 것을 화학적으로 차단하는 것입니다. 이 절차에서, 항체 상의 글라이칸의 cis-diol 기는 먼저 빛을 피하는 아세트산 나트륨 완충액에서 NaIO4를 사용하여 알데히드기로 산화되었습니다. 그런 다음 알데히드기를 가교제의 히드라자이드 그룹인 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl(MPBH)에 접합한 다음, 디펩타이드인 Cys-Gly를 MPBH의 maleimide 그룹에 접합했습니다. 따라서, 항체의 글리칸에 있는 시스-디올기는 부피가 큰 비하이드록실기로 전환되었고, 이는 렉틴 및 기타 GBP가 포획 항체에 결합하는 것을 방해했습니다. 이 차단 절차는 GBP와 렉틴이 포획된 단백질의 글리칸에만 결합하도록 합니다. 이러한 화학적 차단 후, 혈청 샘플을 항체 마이크로어레이로 배양한 후 다른 비오틴화 렉틴 및 GBP를 사용하여 글라이칸을 검출하고 Cy3-스트렙타비딘으로 시각화했습니다. 항체 패널과 다중 렉틴 프로빙(multiple lectin probing)을 병행하여 사용하면 주어진 샘플에서 여러 단백질의 개별 당화(glycosylation) 프로파일을 제공할 수 있습니다 18-20. 이 방법은 여러 다른 실험실 1, 7, 13, 19-31에서 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 MPBH 및 Cys-Gly의 안정성, 이 방법의 복잡하고 확장된 절차는 방법의 재현성, 효과 및 효율성에 영향을 미칩니다. 이 새로운 프로토콜에서는 MPBH와 Cys-Gly를 훨씬 더 안정적인 시약인 글루탐산 히드라지드(Glu-hydrazide)로 대체하여 방법의 재현성을 크게 개선하고 전체 절차를 단순화 및 단축하여 영업일 기준 1일 이내에 완료할 수 있도록 했습니다. 이 새로운 프로토콜에서는 일상적인 단백질 당화(glycosylation) 연구를 위해 일반 실험실에서 쉽게 채택할 수 있는 프로토콜의 세부 절차와 재현 가능하고 반복 가능한 결과를 얻는 데 필요한 기술에 대해 설명합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 분석을위한 항체 Microarray 인쇄

  1. 0.5 MG / 인산염 완충 식염수, 산도 7.2 (PBS)의 ML에 모든 항체를 희석.
  2. 384 잘 소스 판으로 나누어지는 각 항체의 40 μl합니다.
  3. Scienion의 sciFLEXARRAYER의 microarrayer에 384 잘 소스 판을로드합니다.
  4. 목표로 microarrayer에 20의 PATH 환경 microarray 슬라이드를로드합니다.
  5. 27 항체 및 제어 단백질이 9x9 패턴 (그림 1E, 1F)에서 세중의에서 발견되는 48 동일 subarrays를 인쇄할 microarrayer를 설정합니다.
  6. 항체 microarray 슬라이드를 인쇄 microarrayer를 시작합니다.
  7. 항체 microarray 슬라이드를 수집하고, 건조가있는 슬라이드 카세트에 그들을 저장합니다. 진공 실러 (Foodsaver)를 사용하여 비닐 봉투에 카세트를 밀봉 진공 청소기.
  8. 4에 ° C 냉장고에 밀폐 microarray 슬라이드를 저장합니다.

2. 화학적 GBP을 방지하기 위해 항체 Microarray를 차단캡처 항체에 바인딩

microarray 분석은 microarray 슬라이드가 화학적으로 차단됩니다 한번 시작하고 약 8 시간 지속됩니다. 일단 microarray 분석이 완료되어야 시작했습니다 (단계 2-8).

  1. microarray는 냉장고에서 꺼내 슬라이드 타고 30 분 동안 실내 온도로 평형을 유지하다.
  2. 0.1 % 십대 초반 (CBT0와 15 밀리미터 아세트산 나트륨 버퍼 산도 5.0에서 다음 저장 상자에서 슬라이드를 제거하고 간단히 분지 닦고 슬라이드에 한 번 0.1 % 십대 초반 20 (PBST0.1)와 인산염 완충 식염수 산도 7.2에서 그들을 씻어하고, 0.1) 연속 패션 인치 슬라이드 세탁 분지에서 10 분 동안 CBT0.1에서 슬라이드를 품어.
  3. 15 MM 나트륨 아세테이트 버퍼 산도 5.0 (CB)에서 신선한 150 MM NaIO 4를 준비하고 사용 전 빛을 피하면서 냉장고에 분지를 해주고 슬라이드로에 보관하십시오.
  4. CB에서 슬라이드를 제거하고, 항체 측면과 함께 신선한 NaIO 4를 포함하는 유역에 넣어만은. 빛을 피하고, 부드러운가 냉장고에서 4 ° C에서 흔들림과 함께 12 시간 동안 슬라이드 분지 부화 알루미늄 호일과 유역을 포괄합니다.
  5. CB 10 MM 히드라 지드 glutamic 산 (차단기) 300 ML을 준비합니다.
  6. 분지에서 슬라이드를 제거하고, 짧게 3 회 오분 슬라이드 세척 유역의 각 시간에 CB에 린스.
  7. 부드러운 진동으로 실온에서 2 시간 동안 세척 분지 차단기의 슬라이드를 품어.
  8. 분지에서 슬라이드를 제거, 3 분 동안 PBST0.1으로 그들을 씻는다.

3. 소 혈청 알부민과 Microarray에 비 특정 바인딩을 차단 (BSA)

  1. 슬라이드 세탁 분지 0.5 % 십대 초반 (PBST0.5)와 인산염 완충 식염수 산도 7.2에서 1 % BSA 300 ML을 준비하고, 부드럽게 흔들어으로 실온에서 1 시간 분지에서 microarray 슬라이드를 품어.
  2. 삼분 때마다 PBST0.1 세번에 슬라이드를 씻어.
  3. 슬라이드를 올려microarray 슬라이드를 건조하기 위해 2 분을 원심 분리에 1,200 XG에서 슬라이드 랙, 그리고 스핀에서.

4. 각 Subarray를 구분할 수 Microarray 슬라이드쪽으로 인쇄물 왁스 그리드

  1. 70 왁스 imprinter 미리 가열을 15 분 ° C에서.
  2. 왁스로 향하게 항체 측면과 왁스 imprinter으로 차단된 microarray 슬라이드를로드합니다. 부드럽게 골고루 슬라이드로 인쇄물 왁스로 핸들을 당기십시오.

5. Microarray 슬라이드로 세럼 샘플을 적용

  1. 2.4 단계 동안 여러 샘플 (5.1.2) 중에서 한 표본에 glyco 프로 파일링 분석 (5.1.1) 또는 단일 glyco epiptope 측정 중 하나에 대한 혈청 샘플을 준비합니다.
    1. 여러 GBPs합니다 (샘플 실험 1 참조)을 사용하여 하나씩 혈청 시료에서 여러 혈청 glycoproteins의 glycan profilings에 대한 실험에서는, 혈청 샘플은 모든 subarrays에 적용됩니다. 이 경우, 40 μl 혈청 충분한은 0.1 %를 포함하는 PBS 360 μl에 희석되어십대 초반-20, 0.1 % Brij 35, 100 μg / 마우스 IgG, 100 μg / 쥐 IgG의 ML, 100 μg / 토끼 IgG, 100 μg / 산양 IgG의 ML 100 μg / 당나귀 IgG의 ML의 ML의 ML. 이 볼륨은 각 subarray에 희석 혈청 용액 중 6 μl를 적용하기위한 충분합니다.
    2. 한 GBP 탐지합니다 (샘플 실험 2 참조)를 사용하여 여러 개의 혈청 샘플 간의 여러 혈청 단백질에 관한 한 glycan 측정을위한 실험합니다. 이 경우, 1 μl 혈청 충분한는 PBS가 0.1 %를 포함하는 9 μl에 희석되어 십대 초반-20, 0.1 % Brij 35, 마​​우스 IgG, 100 μg / 쥐 IgG의 ML, 100 μg / 토끼 IgG의 ML 100 μg / ML , 100 μg / 산양 IgG과 100 μg / 당나귀 IgG의 ML의 ML. 이 볼륨은 각 subarray에 희석 혈청 용액 중 6 μL를 적용하기위한 충분합니다.
  2. 4 단계에서 왁스 인쇄물은 조심스럽게 슬라이드의 각 subarray로 희석 시료 또는 제어 샘플 6 μL (PBST0.1)를 적용한 후에. 상온에서 젖은 종이 타월로 humidified 카세트에서 슬라이드를 품어1 시간 정도.
  3. 삼분 각 시간 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 씻어.
  4. 이분에 대한 1,200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.

6. 슬라이드에 Biotinylated GBP을 (렉틴 또는 안티 glycan 항체) 적용

  1. 2.4 단계 동안 PBST0.1에 biotinylated lectins / GBPs의 10μg/ml를 준비합니다.
    1. glycan 프로 파일링 실험에서 여러 lectins와 프로브 한 샘플 (샘플 실험 1) 모든 subarrays하기에 충분 biotinylated 렉틴 350 μL를 준비니다.
    2. 여러 lectins를 사용하여 여러 샘플에서 단일 glycan 에피토프 / biomarker 심사에서는, subarray하기에 충분 각 biotinylated 렉틴 10 μl를 준비합니다.
  2. 슬라이드의 각 subarray로 희석된 biotinylated 렉틴 (들) 6 μL를 적용, 1 시간 동안 실온에서 젖은 종이 타월로 humidified 슬라이드 상자에서 품어.
  3. 삼분 각 TI에 대해 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 헹구어나.
  4. 이분을위한 원심 분리기 1200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.

7. 형광 검출을위한 염료 라벨 NeutrAvidin를 적용

  1. 모든 subarrays하기에 충분 Dylight 549 분류 NeutrAvidin 350 μL를 준비합니다.
  2. 각 subarray에 Dylight 549 분류 NeutrAvidin 6 μL를 적용, 1 시간 동안 실온에서 humidified 슬라이드 카세트에서 슬라이드를 품어.
  3. 삼분 각 시간 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 씻어.
  4. 이분을위한 원심 분리기 1200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.

8. 슬라이드를 스캔하여 Microarray 슬라이드 이미지를 구합니다

  1. 10 μm의 해상도에서 형광 microarray 스캐너를 사용하여 슬라이드를 검사합니다. 레이저와 PMT 설정은 최대한 강해 져야한다,하지만 포화 지점을 준수하지 않습니다.

9. 데이터 추출 및 분석

  1. ArrayPro 3.2 이미지를 엽니다.
    2. 항체 명소 위치를 보여주는 배열의지도에 따라 배열 템플릿을 설정합니다. 조심스럽게 이미지의 해당 지점에 각 템플릿 원을 맞춥니다.
  2. 추가 분석을 위해 엑셀 파일에 각 지점의 강도의 압축을 풉니다.

10. 대표 결과

샘플 실험 1

여러 lectins 검출과 화학적 차단 항체 microarray를 사용하여 간세포암 환자의 혈청 샘플에서 여러 혈청 glycoproteins의 글리코 실화 프로 파일링.

이 실험의 목표는 렉틴 탐지와 화학적으로 차단 항체 microarray를 사용하여 간세포암 (HCC) 환자의 혈청 샘플의 20 glycoproteins의 개별 글리코 실화 프로필을 탐구하는 것입니다. S에서 설명한대로 26 항체와 비오틴-BSA를 포함 48 동일한 subarrays를 포함 항체 microarray는, 설계 및 제조되었습니다한 tep. 이러한 26 항체는 표 1에서와 같이 대량 spectrometric 단백질 식별 12, 32와 결합 렉틴 ​​기반 immunoprecipitation를 사용하여 HCC 환자에 대한 조기 진단 가치를 약속하는 것으로 판별 20 혈청 glycoproteins에 반대했다. 한 대표 subarray의 세중의에 인쇄된 항체 명소의 패턴과 배열은 각각 그림 1E 및 1 층에 표시됩니다. 다른 하나는 (그림 1B), 분석 화학적 차단 절차의 중요성을 설명하기 위해 동일한 글리코 실화 프로 파일링 실험을 수행하는 데 사용된 동안 두 개의 동일한 microarray 슬라이드, 하나는 화학적, (그림 1A) 차단 아니었어요. 화학적 차단 슬라이드 (그림 1B)의 경우 실험은 2 단계에서 시작; 없음 화학적으로 차단 슬라이드 (그림 1A)에 대해, 실험은 3 단계부터 시작했습니다. 실험 따라와에 의해 실시되었다g 단계 5.1.2과 6.1.2를 제외한 프로토콜에 설명된 모든 단계. 단계 5.2에서 PBST0.1 제어 예제는 컬럼 1과 3의 subarrays에 적용되었고, 풀링된 HCC 혈청 샘플 (그림 1G 참조) 컬럼이 각각 4, 관련 subarrays에 적용되었다. 이 비교는 화학적으로 차단 후 효과, 절차의 효율성뿐만 아니라 항체의 항원 결합 친화력을 보여주는 것입니다. 글리코 실화 프로 파일링을 위해 그림 1G 같이 다른 glycans 18, 20 ~ 구체적인 각 subarray에 적용되었다는 22 biotinylated lectins합니다 (표 1 참조). 프로토콜에 따라 글리코 실화 프로 파일링 분석 후 화학적으로 차단 (그림 1B)와 조미료를 차단합니다 (그림 1A) microarrays의 이미지. 마찬가지로 조미료를 차단 microarrays (그림 1A 및 그림 1C), 열의 1과 3의 subarrays에 표시되는에오직 PBST0.1 대부분 lectins는 항체를 캡처하는 구속, 적용 및 혈청 샘플을 적용하는 컬럼 2, 4, 사람들을 subarrays에 해당 비교할 매우 높은 배경을 보여줬습니다. 그것은이 microarray 슬라이드에서 glycan의 프로필 정보를 얻는 것은 불가능합니다. 반대로 같은 실험을 화학적으로 차단 항체 microarray 슬라이드에서 수행했을 때, 열 1과 유일한 PBST0.1이 적용되었다되는 3의 subarrays, 대부분의 lectins는 항체를 캡처 없거나 매우 낮은 바인딩을 보여주 없으며 당분간 높은 항원 바인딩은 여전히 혈청 샘플 (그림 1B와 1D) 적용된있는, 컬럼 2, 4 subarrays에서 관찰되었다. 이러한 결과는 화학적으로 차단 절차 항체-캡처한 glycoproteins에 glycans의 측정 이물 중요한 단계였다 보여주었다. 프로토콜에 따라, HCC 혈청 22 glycoproteins의 글리코 실화 프로파일 얻을 수 있습니다.

실험 2

변경된 fucos위한 화면차별 간의 간경변 및 간세포암 환자에 대한 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에 ylation.

이 실험의 목표는 간암 간경변과 간세포암 (HCC) 환자를 차별 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에서 변경된 fucosylation위한 화면입니다. 이러한 분석에 하나의 혈청 샘플은 모든 subarrays에 적용된 각종 lectins로 탐지되었다하는 실험 1, HCC 및 간경변 환자에서 총 40 가지 혈청 시료에서 서로 다른 각 subarray에 적용, 하나의 렉틴 (AAL로 탐지되었습니다 ). 이러한 T 테스트, 리시버 - 운영 특성 (ROC) 곡선과 같은 통계 분석은 배포판 또는 모든 혈청 샘플의 각 개별 단백질의 glycan epiptope / biomarker의 진단 성능을 평가하기 위해 이루어졌다. 우리는이 연구에서 안티 CA19-9 및 안티 루이스 X의 항체를 제외한 실험 1에서 제조된 동일한 항체 microarray를 사용했습니다. experiment는 단계 5.1.1와 6.1.1을 제외하고 9 단계로 9월 2일에서 실시되었다. 총 20 간경변 40 혈청 샘플 및 20 HCC 환자가 부정적인 컨트롤과 같은 컨트롤 PBS 샘플과 함께 48 subarrays의 무작위 subarray에서 적용되었다. 각 캡처된 단백질의 Fucosylation 그 후 biotinylated Fucose 특정 렉틴를 사용하여 감지되었습니다. 그림 1에 표시된 microarray 이미지는 대신 캡처한 항체의 microarray (그림 2D) (그림 2E)에서 캡처한 혈청 단백질에 바인딩 렉틴 AAL을 보여주었다. 모든 명소 AAL 바인딩 농도는 다음 추출하고, HCC 및 간경변 그룹 간의 차별의 각 혈청 단백질의 fucosylation (AAL 결합 강도)의 성능을 평가하는 T 테스트 및 ROC 곡선을 사용하여 분석되었다. 결과는 GP73 단백질의 fucosylation가 P와 함께 = 0.03를 두 그룹 사이에 최고의 차별을 준 지역 언더파-것으로 나타났다ROC 곡선의 곡선은 0.72로 같습니다. 이 실험은이 절차는 여러 단백질 내에서 여러 샘플에서 glycan의 에피토프 / biomarker 검사를위한 신속하고 효율적인 방법입니다 보여주었다.

신분증 시약의 이름 약어 회사 # 카탈로그
L1 Biotinylated Concanavalin ConA 벡터 연구소 BK-1000
L2 Biotinylated Sambucus Nigra의 렉틴 SNA 벡터 연구소 B-1305
L3 Biotinylated 렌즈 Culinaris Agglutinin LCA 벡터 연구소 BK-2000
L4 Ricinus Communis Agglutinin 봐도 Biotinylated RCA 벡터 연구소 BK-1000
5 번 Biotinylated Aleuria Aurantia의 렉틴 AAL 벡터 연구소 B-1395
L6 Biotinylated Erythrina Cristagalli의 렉틴 ECL 벡터 연구소 BK-3000
L7 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 II GSL II 벡터 연구소 BK-3000
L8 Biotinylated 밀 배아 Agglutinin WGA 벡터 연구소 BK-1000
L9 Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Erythroagglutinin PHA-E 벡터 연구소 BK-2000
10 파운드 라니 Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Leucoagglutinin PHA-L 벡터 연구소 BK-2000
L11 바이오tinylated 땅콩 Agglutinin PNA 벡터 연구소 BK-1000
L12 Pisum Sativum Agglutinin을 Biotinylated PSA 벡터 연구소 BK-2000
L13 Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin DBA 벡터 연구소 BK-1000
L14 Biotinylated 흰독말풀의 가시독말풀의 렉틴 DSL 벡터 연구소 BK-3000
L15 Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin SJA 벡터 연구소 BK-2000
L16 Biotinylated 대두 Agglutinin SBA 벡터 연구소 BK-1000
L17 Biotinylated Solanum Tuberosum (감자) 렉틴 STL 벡터 연구소 BK-3000
L18 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia의 렉틴 I GSL 전 벡터 연구소 BK-2000
L19 Biotinylated Vicia 비오의 렉틴 VVL 벡터 연구소 BK-2000
L20 Biotinylated Lycopersicon Esculentum (토마토) 렉틴 LEL 벡터 연구소 BK-3000
L21 Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin 전 UEA 전 벡터 연구소 BK-1000
L22 Biotinylated Jacalin JACALIN 벡터 연구소 BK-3000
A1 염소 F (AB ') 2 조각 반 인간 IgM, Fc5μ 항체 IgM 잭슨 Immuno 연구 109-006-129
A2 돈키 F (AB ') 2Frag 안티 - 인간 IgG (H + L) 항체 AB1 잭슨 Immuno 연구 709-006-149
A3 마우스 안티 인간 IgG F (AB ') 2 단클론 항체 AB3 잭슨 Immuno 연구 209-005-097
A4 염소 안티 인간의 알파 2 macroglobulin polyclonal 항체 A2M GeneTex GTX62924
A5 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 A1AT 리 Biosiences CA1T-80A
A6 마우스 안티 인간 알파-1-antitrypsin 단클론 항체 A1AT 시그마 알드리치 SAB4200198
A7 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 주문 NeoMarkers RB-367-A1
A8 토끼 반 인간 알파 -1 - 익살스러운 몸짓hymotrypsin polyclonal 항체 주문 피셔 과학 RB9213R7
A9 마우스 안티 인간 트랜스페린 단클론 항체 트랜스페린 GeneTex GTX101035
A10 토끼 반 인간 트랜스페린 polyclonal 항체 트랜스페린 GeneTex GTX77130
A11 염소 안티 인간 apolipoprotein J polyclonal 항체 ApoJ Abcam ab7610
A12 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 GP73 애보트 14H4-23
A13 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 GP73 산타 크루즈 생명 공학 INC SC-101275
A14 토끼 반 인간의 알파 페토 프로테인-1 polyclonal 항체 AFP GenWay GWB-41C966
A15 마우스 안티 인간의 알파 페토 프로테인-1 단클론 항체 AFP 피츠제럴드 10-A05A
A16 마우스 안티 인간 hemopexin 단클론 항체 Hemopexin Assaypro 60190-05011
대답 17 마우스 안티 인간 glypican-3 (1G12) 단클론 항체 GPL3 산타 크루즈 바이오 SC-65443
대답 18 마우스 안티 인간 Kininogen (LMW) 단클론 항체 Kininogen Assaypro 20333-05011
대답 19 토끼 반 인간 MMP-21 단클론 항체 MMP21 Epitomic 1955-1
A20 마우스 안티 인간 CEACAM-1 단클론 항체 CEACAM R & D 시스템 MAB1180
21 쥐 안티 인간 DPPIV/CD26 단클론 항체 DPPIV R & D 시스템 MAB22441
대답 22 마우스 안티 인간 PIVKA II 단클론 항체 PIVICA 크리스탈 화학 8040
대답 23 마우스 안티 carcinoembryonic 항원 CEA 미국 생물학 C1300
대답 24 마우스 방지 CA125 암 항원 CA125 미국 생물학 C0050-01D
대답 25 마우스 방지 CA19-9 암 항원 CA19-9 미국 생물학 C0075-18
대답 26 마우스 방지 루이스 X 단클론 항체 루이스 X Calbiochem 434,631
바이오 Biotinylated BSA (긍정적인 제어) 바이오 집에서 만든 N / A

이 프로토콜에서 사용 lectins 및 항체의 표 1.리스트.

시약 S / 장비의 명칭 회사 카탈로그 번호
비 접촉 microarrayer BioDot INC sciFLEXARRAYER
384 microplate 어부 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray는 슬라이드 Gentel PATH
슬라이드 Imprinter (옵션) 젤 회사 WSP60-1
흔드는 사람 어부 15-453-211
원심 분리기 Eppendorf 5804 000.013
분지 / 슬라이드 염색법 요리 WI 닦고 슬라이드일 이동식 랙 어부 08-812
슬라이드 배양 챔버 / 현미경 슬라이드 박스 어부 03-448-5
Brij 35, 물 30 W / V % 용액 Acros의 생명체 AC32958-0025
십대 초반-20 어부 P337-100
나트륨 Periodate (NaIO 4) 시그마 311,448
L-글루탐산 γ-히드라 지드 시그마 G-7257
나트륨 아세테이트 무수 (CH 3 COONa) 시그마 S2889
소 혈청 알부민 (BSA) Lampire 생물학 실험실 7,500,804
인산 버퍼 식염수 (PBS) (10X) Denville 과학 CP4390-48
Dylight 549 복합 NeutrAvidin 써모 22,837
테아제 억제제 칵테일 정제 로슈 4693159001
ChromPure 인간 IgG, FC 조각 잭슨 Immunoresearch 009-000-008
ChromPure 인간 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 009-000-003
ChromPure 마우스 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 015-000-003
ChromPure 마우스 IgG, FC 조각 잭슨 Immunoresearch 015-000-008
ChromPure 토끼 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 011-000-003
ChromPure 돈키 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 017-000-003
Microarray 스캐너 Tecan LS는 리로디드

표 2.리스트이 프로토콜에 사용되는 장비와 시약의.

figure-protocol-1
계획은 1 glycan의 biomarker 발견 과정 1 (2 단계 4) 기반 렉틴 항체 microarray 보여주는 방식 : 차단기 (GLU - 히드라 지드)와 BSA와 항체 microarray 차단, 2 (5 단계) :.. 혈청 샘플을 적용하고 캡처 특정 항체와 특정 glycoproteins, 3 (6 단계) :; 프로브 microarray 이미징을위한 Dylight 549 분류 NeutrAvidin와 biotinylated AAL. 4 (7 단계) biotinylated 렉틴 (들)을 적용

figure-protocol-2
chemic 사용하여 HCC 환자 혈청 샘플에서 여러 혈청 glycoproteins의 샘플 실험 1 글리코 실화 프로 파일링의 그림 1. Microarray 이미지동맹국은 여러 렉틴 검출과 항체 microarray를 차단했습니다. 두 개의 동일한 microarray 슬라이드는 () 아무도 화학적으로 차단하지, 또는 (b) 화학적으로 차단과 같은 2 단계의 설명에 모두 모두 글리코 실화 프로 파일링 2부터 9 단계뿐만 아니라 비교 용도로 갔다. (A)와 (B) microarray 이미지는 10 미크론의 해상도에서 8 단계에서 스캔합니다. 비 화학적 차단 microarray 슬라이드 (B))의 처음 두 행의 이미지 (D) 확대,, (C) 없음의 처음 두 행의 이미지의 확대는 화학적으로 microarray 슬라이드 () 차단 (E) 각 subarray 내에서 항체 배열의 다이어그램, (F) 배열지도 : subarray 각 항체의 위치, 각 항체 이름 3 장소를 나타내는, (G) 혈청 샘플과 렉틴 장소 : 각 혈청 샘플을 subarray 다이어그램 보여주 및 렉틴가에 적용되었다.

figure-protocol-3
의 그림 2. Microarray 이미지간암 간경변 및 HCC 환자를 차별하는 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에서 변경된 fucosylation위한 샘플 실험이 화면. 샘플 실험이 섹션에서 설명한대로 microarray 분석이 실시되었다. () 8 단계에서 microarray 슬라이드의 전체 슬라이드 이미지가 있으며, 각 subarray 내에 항체 배열의 (B) 그림은, (C) 배열지도 : subarray 각 항체의 위치, 각 항체 이름은 3 반점을 나타냅니다; (D) 확대의 혈청 샘플과 함께 incubated 있었다 subarray의 이미지를, (E) 줌 - 인 PBS 제어 incubated 있었다 subarray의 이미지입니다.

figure-protocol-4
그림 3. 샘플 실험 1에서 Glycan 프로 파일링 결과입니다. 각 막대 그래프가 20 테스트를 거친 단백질 중 하나의 렉틴 결합 프로파일 (또는 glycan 프로필에) 나타냅니다. 총 22 가지 lectins는 일을 분석하기 위해 사용되었다각 단백질의 전자 glycan 프로필.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 대상 단백질과 캡처 항체 선택

항체 microarray 분석에 앞서, 몇 가지 시약 및 재료는 고려가 필요하고 준비가되어 있습니다. glycan 프로 파일링 또는 glycan의 biomarker 검사, 당단백질 후보에 대한 특정 항체의 패널에 대한 항체 microarray를 디자인하기 위해서는 문학에 또는 이전 결과에 따라 결정되어야한다. 이러한 항체는 일반적으로 이러한 R & D 시스템 등 IgGs 등 다양한 업체에서 구입했습니다 이전 테스트를 몇 가지 IgM과 IGE 완전히 화학적 변형 후에 그들의 항원 결합 동질성을 잃을 수도 보여준 이후 캡처 항체를 선호하고 있습니다.

2. 디자인 및 항체 microarray의 제조

항체 microarray의 제조는 전문적이고 비싼 microarrayer, 그리고 작업에 대한 잘 훈련된 인력이 필요한 단계는 선택 사항입니다. 그러나...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 간염과 바이러스 연구소에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
신분증 시약의 이름 약어 회사 # 카탈로그
L1 Biotinylated Concanavalin ConA 벡터 연구소 BK-1000
L2 Biotinylated Sambucus Nigra의 렉틴 SNA 벡터 연구소 B-1305
L3 Biotinylated 렌즈 Culinaris Agglutinin LCA 벡터 연구소 BK-2000
L4 Ricinus Communis Agglutinin 봐도 Biotinylated RCA 벡터 연구소 BK-1000
5 번 Biotinylated Aleuria Aurantia의 렉틴 AAL 벡터 연구소 B-1395
L6 Biotinylated Erythrina Cristagalli의 렉틴 ECL 벡터 연구소 BK-3000
L7 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 II GSL II 벡터 연구소 BK-3000
L8 Biotinylated 밀 배아 Agglutinin WGA 벡터 연구소 BK-1000
L9 Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Erythroagglutinin PHA-E 벡터 연구소 BK-2000
10 파운드 라니 Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Leucoagglutinin PHA-L 벡터 연구소 BK-2000
L11 Biotinylated 땅콩 Agglutinin PNA 벡터 연구소 BK-1000
L12 Pisum Sativum Agglutinin을 Biotinylated PSA 벡터 연구소 BK-2000
L13 Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin DBA 벡터 연구소 BK-1000
L14 Biotinylated 흰독말풀의 가시독말풀의 렉틴 DSL 벡터 연구소 BK-3000
L15 Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin SJA 벡터 연구소 BK-2000
L16 Biotinylated 대두 Agglutinin SBA 벡터 연구소 BK-1000
L17 Biotinylated Solanum Tuberosum (감자) 렉틴 STL 벡터 연구소 BK-3000
L18 Biotinylated Griffonia (밴드eiraea) Simplicifolia의 렉틴 I GSL 전 벡터 연구소 BK-2000
L19 Biotinylated Vicia 비오의 렉틴 VVL 벡터 연구소 BK-2000
L20 Biotinylated Lycopersicon Esculentum (토마토) 렉틴 LEL 벡터 연구소 BK-3000
L21 Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin 전 UEA 전 벡터 연구소 BK-1000
L22 Biotinylated Jacalin JACALIN 벡터 연구소 BK-3000
A1 염소 F (AB ') 2 조각 반 인간 IgM, Fc5μ 항체 IgM 잭슨 Immuno 연구 109-006-129
A2 돈키 F (AB ') 2 Frag 안티 - 인간 IgG (H + L)tibody AB1 잭슨 Immuno 연구 709-006-149
A3 마우스 안티 인간 IgG F (AB ') 2 단클론 항체 AB3 잭슨 Immuno 연구 209-005-097
A4 염소 안티 인간의 알파 2 macroglobulin polyclonal 항체 A2M GeneTex GTX62924
A5 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 A1AT 리 Biosiences CA1T-80A
A6 마우스 안티 인간 알파-1-antitrypsin 단클론 항체 A1AT 시그마 알드리치 SAB4200198
A7 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 주문 NeoMarkers RB-367-A1
A8 래빗 안티 인간알파-1-antichymotrypsin polyclonal 항체 주문 피셔 과학 RB9213R7
A9 마우스 안티 인간 트랜스페린 단클론 항체 트랜스페린 GeneTex GTX101035
A10 토끼 반 인간 트랜스페린 polyclonal 항체 트랜스페린 GeneTex GTX77130
A11 염소 안티 인간 apolipoprotein J polyclonal 항체 ApoJ Abcam ab7610
A12 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 GP73 애보트 14H4-23
A13 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 GP73 산타 크루즈 생명 공학 INC SC-101275
A14 토끼 반 인간 알파-1 fetoprotein polyclonal 항체 AFP GenWay GWB-41C966
A15 마우스 안티 인간의 알파 페토 프로테인-1 단클론 항체 AFP 피츠제럴드 10-A05A
A16 마우스 안티 인간 hemopexin 단클론 항체 Hemopexin Assaypro 60190-05011
대답 17 마우스 안티 인간 glypican-3 (1G12) 단클론 항체 GPL3 산타 크루즈 바이오 SC-65443
대답 18 마우스 안티 인간 Kininogen (LMW) 단클론 항체 Kininogen Assaypro 20333-05011
대답 19 토끼 반 인간 MMP-21 단클론 항체 MMP21 Epitomic 1955-1
A20 마우스 안티 인간 CEACAM-1 단클론 antibodY CEACAM R & D 시스템 MAB1180
대답 21 쥐 안티 인간 DPPIV/CD26 단클론 항체 DPPIV R & D 시스템 MAB22441
대답 22 마우스 안티 인간 PIVKA II 단클론 항체 PIVICA 크리스탈 화학 8040
대답 23 마우스 안티 carcinoembryonic 항원 CEA 미국 생물학 C1300
대답 24 마우스 방지 CA125 암 항원 CA125 미국 생물학 C0050-01D
대답 25 마우스 방지 CA19-9 암 항원 CA19-9 미국 생물학 C0075-18
대답 26 마우스 방지 루이스 X 단클론 항체 루이스 X Calbiochem 434,631
바이오 Biotinylated BSA (긍정적인 제어) 바이오 집에서 만든 N / A

이 프로토콜에서 사용 lectins 및 항체의 표 1.리스트.

시약 S / 장비의 명칭 회사 카탈로그 번호
비 접촉 microarrayer BioDot INC sciFLEXARRAYER
384 microplate 어부 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray는 슬라이드 Gentel PATH
슬라이드 Imprinter (옵션) 젤 회사 WSP60-1
흔드는 사람 어부 15-453-211
원심 분리기 Eppendorf 5804 000.013
이동식 랙과 슬라이드 씻는 세면대 / 슬라이드 염색법 요리 어부 08-812
슬라이드 배양 챔버 / 현미경 슬라이드 박스 어부 03-448-5
Brij 35, 물 30 W / V % 용액 Acros의 생명체 AC32958-0025
십대 초반-20 어부 P337-100
나트륨 Periodate (NaIO 4) 시그마 311,448
L-글루탐산 γ-히드라 지드 시그마 G-7257
나트륨 아세테이트 무수 (CH 3 COONa) 시그마 S2889
소 혈청 알부민 (BSA) Lampire 생물학 실험실 7,500,804
인산 버퍼 식염수 (PBS) (10X) Denville 과학 CP4390-48
Dylight 549 복합 NeutrAvidin 써모 22,837
테아제 억제제 칵테일 정제 로슈 4693159001
ChromPure 인간 IgG, FC 조각 잭슨 Immunoresearch 009-000-008
ChromPure 인간 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 009-000-003
ChromPure 마우스 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 015-000-003
ChromPure 마우스 IgG, FC 조각 잭슨 Immunoresearch 015-000-008
ChromPure 토끼 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 011-000-003
ChromPure 돈키 IgG, 전체 분자 잭슨 Immunoresearch 017-000-003
Microarray 스캐너 Tecan LS는 리로디드

이 프로토콜에 사용되는 장비와 시약의 표 2.리스트.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).

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