단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

Chen Lu; Joshua L. Wonsidler; Jianwei Li; Yanming Du; Timothy Block; Brian Haab; Songming Chen

doi:10.3791/3791

방법 논문

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

DOI:

10.3791/3791

⸱

2012년 5월 4일

Chen Lu¹ , Joshua L. Wonsidler¹ , Jianwei Li² , Yanming Du¹ , Timothy Block³ , Brian Haab⁴ , Songming Chen¹

¹Institute for Hepatitis and Virus Research, ²Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, ³Drexel University College of Medicine, ⁴Van Andel Research Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 특정 단백질의 당화 프로파일링이 가능한 당 결합 단백질 검출 기반의 다중 고처리량 항체 마이크로어레이 활용을 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 단백질의 당화는 단백질에서 발견되는 가장 일반적인 번역 후 변형으로, 단백질의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성의 다양화된 변형을 유도합니다. 당화 기전은 특히 질병의 진행과 악성 변형에 민감하기 때문에, 비정상적인 당화는 암 및 기타 질병의 조기 진단 마커로 인식되어 왔습니다. 그러나 단백질 당화를 연구하는 현재의 방법들은 일반적으로 너무 복잡하거나 비용이 많이 들어 대부분의 일반적인 실험실이나 임상 환경에서 사용하기 어려우며, 보다 실용적인 단백질 당화 연구 방법이 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 새로운 프로토콜은 당 결합 단백질(GBP) 검출이 가능한 화학적 차단 항체 마이크로어레이를 활용하며, 단백질 당화 연구에 필요한 시간, 비용 및 실험 장비 요구 사항을 크게 줄여줍니다. 이 방법에서는 여러 개의 고정된 당단백질 특이적 항체를 마이크로어레이 슬라이드에 직접 프린팅하고 항체의 N-glycan을 차단합니다. 이렇게 차단 및 고정된 당단백질 특이적 항체는 마이크로어레이 슬라이드에 직접 도포된 복합 시료로부터 당단백질을 캡처하고 분리할 수 있습니다. 그 다음, 비오틴화된 렉틴 및 기타 GBP를 마이크로어레이 슬라이드에 도포하여 당 검출을 수행할 수 있으며, 결합 수준은 Dylight 549-Streptavidin을 사용하여 결정할 수 있습니다. 항체 패널의 사용과 여러 비오틴화 렉틴을 이용한 프로빙을 통해, 이 방법은 주어진 인간 또는 동물 시료에서 발견되는 서로 다른 단백질들의 효과적인 당화 프로파일을 구축할 수 있게 합니다.

서론

단백질의 가장 보편적인 번역 후 변형인 단백질 당화(Glycosylation)는 단백질의 물리적, 화학적, 생물학적 특성을 변화시키며, 다양한 생물학적 과정에서 핵심적인 역할을 합니다^1-6. 당화 기제는 질병의 진행 및 악성 변형에 특히 민감하기 때문에, 비정상적인 당화는 암 및 기타 질환의 조기 진단 바이오마커로 인식되어 왔습니다^7-12. 실제로 간세포암의 α-1 fetoprotein (AFP) L3 분획^13-15 및 췌장암의 CA199^{16, 17}와 같은 대부분의 현재 암 바이오마커들은 모두 당단백질의 비정상적인 글리칸 부분(glycan moieties)입니다. 그러나 단백질 당화를 연구하는 방법들은 복잡하여 일반적인 실험실 및 임상 환경에 적합하지 않았습니다. 최근 Chen et al.은 복잡한 시료 내 천연 당단백질의 고처리량 및 다중 프로파일 당화 분석을 위해 글리칸 결합 단백질(GBP) 검출법을 이용한 화학적 차단 항체 마이크로어레이를 개발하였습니다¹⁸. 이 친화성 기반 마이크로어레이 방법에서는 마이크로어레이 슬라이드 상에 고정된 여러 개의 당단백질 특이적 항체들이 복잡한 혼합물로부터 당단백질을 직접 포획 및 분리하며, 포획된 개별 단백질의 글리칸은 GBP에 의해 측정됩니다. 모든 일반적인 항체는 대부분의 GBP에 의해 인식될 수 있는 N-글리칸을 포함하고 있으므로, 이 방법의 핵심 단계는 항체의 글리칸이 GBP와 결합하지 못하도록 화학적으로 차단하는 것입니다. 이 절차에서는 빛을 차단한 소듐 아세테이트 완충액 내에서 NaIO₄를 사용하여 항체 글리칸의 cis-디올 그룹을 먼저 알데히드 그룹으로 산화시켰습니다. 그 후 알데히드 그룹을 가교제인 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH)의 하이드라자이드 그룹에 접합시키고, 이어서 MPBH의 말레이미드 그룹에 디펩타이드인 Cys-Gly를 접합시켰습니다. 결과적으로 항체 글리칸의 cis-디올 그룹이 부피가 큰 비히드록실 그룹으로 전환되어, 렉틴 및 기타 GBP가 포획 항체에 결합하는 것을 방해하게 됩니다. 이러한 차단 절차를 통해 GBP와 렉틴이 포획된 단백질의 글리칸에만 결합하게 됩니다. 이렇게 화학적 차단을 거친 후, 혈청 시료를 항체 마이크로어레이와 반응시키고, 이어서 서로 다른 비오틴화 렉틴 및 GBP를 사용하여 글리칸을 검출한 뒤 Cy3-streptavidin으로 시각화하였습니다. 항체 패널과 다중 렉틴 프로빙을 병행 사용함으로써 주어진 시료 내 여러 단백질의 개별적인 당화 프로파일을 얻을 수 있습니다^18-20. 이 방법은 여러 다른 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다^{1, 7, 13, 19-31}. 하지만 MPBH와 Cys-Gly의 안정성 문제, 그리고 이 방법의 복잡하고 긴 절차는 방법의 재현성, 효과 및 효율성에 영향을 주었습니다. 본 새로운 프로토콜에서는 MPBH와 Cys-Gly 모두를 훨씬 더 안정적인 시약인 글루탐산 하이드라자이드(Glu-hydrazide) 하나로 대체하였으며, 이를 통해 방법의 재현성을 크게 향상시키고 전체 절차를 단순화 및 단축하여 단 하루의 근무 시간 내에 완료할 수 있게 하였습니다. 이 새로운 프로토콜에서는 일반 실험실에서 일상적인 단백질 당화 연구에 쉽게 도입할 수 있는 상세한 절차와 재현 가능하고 반복 가능한 결과를 얻는 데 필요한 기술을 설명합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 분석을위한 항체 Microarray 인쇄

0.5 MG / 인산염 완충 식염수, 산도 7.2 (PBS)의 ML에 모든 항체를 희석.
384 잘 소스 판으로 나누어지는 각 항체의 40 μl합니다.
Scienion의 sciFLEXARRAYER의 microarrayer에 384 잘 소스 판을로드합니다.
목표로 microarrayer에 20의 PATH 환경 microarray 슬라이드를로드합니다.
27 항체 및 제어 단백질이 9x9 패턴 (그림 1E, 1F)에서 세중의에서 발견되는 48 동일 subarrays를 인쇄할 microarrayer를 설정합니다.
항체 microarray 슬라이드를 인쇄 microarrayer를 시작합니다.
항체 microarray 슬라이드를 수집하고, 건조가있는 슬라이드 카세트에 그들을 저장합니다. 진공 실러 (Foodsaver)를 사용하여 비닐 봉투에 카세트를 밀봉 진공 청소기.
4에 ° C 냉장고에 밀폐 microarray 슬라이드를 저장합니다.

2. 화학적 GBP을 방지하기 위해 항체 Microarray를 차단캡처 항체에 바인딩 <....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 대상 단백질과 캡처 항체 선택

항체 microarray 분석에 앞서, 몇 가지 시약 및 재료는 고려가 필요하고 준비가되어 있습니다. glycan 프로 파일링 또는 glycan의 biomarker 검사, 당단백질 후보에 대한 특정 항체의 패널에 대한 항체 microarray를 디자인하기 위해서는 문학에 또는 이전 결과에 따라 결정되어야한다. 이러한 항체는 일반적으로 이러한 R & D 시스템 등 IgGs 등 다양한 업체에서 구입했습니다 이전 테스트를 몇 가지 IgM과 IGE 완전히 화학적 변형 후에 그들의 항원 결합 동질성을 잃을 수도 보여준 이후 캡처 항체를 선호하고 있습니다.

2. 디자인 및 항체 microarray의 제조

항체 microarray의 제조는 전문적이고 비싼 microarrayer, 그리고 작업에 대한 잘 훈련된 인력이 필요한 단계는 선택 사항입니다. 그러나.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 간염과 바이러스 연구소에 의해 지원되었다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
신분증	시약의 이름	약어	회사	# 카탈로그
L1	Biotinylated Concanavalin	ConA	벡터 연구소	BK-1000
L2	Biotinylated Sambucus Nigra의 렉틴	SNA	벡터 연구소	B-1305
L3	Biotinylated 렌즈 Culinaris Agglutinin	LCA	벡터 연구소	BK-2000
L4	Ricinus Communis Agglutinin 봐도 Biotinylated	RCA	벡터 연구소	BK-1000
5 번	Biotinylated Aleuria Aurantia의 렉틴	AAL	벡터 연구소	B-1395
L6	Biotinylated Erythrina Cristagalli의 렉틴	ECL	벡터 연구소	BK-3000
L7	Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 II	GSL II	벡터 연구소	BK-3000
L8	Biotinylated 밀 배아 Agglutinin	WGA	벡터 연구소	BK-1000
L9	Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Erythroagglutinin	PHA-E	벡터 연구소	BK-2000
10 파운드 라니	Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Leucoagglutinin	PHA-L	벡터 연구소	BK-2000
L11	Biotinylated 땅콩 Agglutinin	PNA	벡터 연구소	BK-1000
L12	Pisum Sativum Agglutinin을 Biotinylated	PSA	벡터 연구소	BK-2000
L13	Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin	DBA	벡터 연구소	BK-1000
L14	Biotinylated 흰독말풀의 가시독말풀의 렉틴	DSL	벡터 연구소	BK-3000
L15	Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin	SJA	벡터 연구소	BK-2000
L16	Biotinylated 대두 Agglutinin	SBA	벡터 연구소	BK-1000
L17	Biotinylated Solanum Tuberosum (감자) 렉틴	STL	벡터 연구소	BK-3000
L18	Biotinylated Griffonia (밴드eiraea) Simplicifolia의 렉틴 I	GSL 전	벡터 연구소	BK-2000
L19	Biotinylated Vicia 비오의 렉틴	VVL	벡터 연구소	BK-2000
L20	Biotinylated Lycopersicon Esculentum (토마토) 렉틴	LEL	벡터 연구소	BK-3000
L21	Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin 전	UEA 전	벡터 연구소	BK-1000
L22	Biotinylated Jacalin	JACALIN	벡터 연구소	BK-3000
A1	염소 F (AB ') 2 조각 반 인간 IgM, Fc5μ 항체	IgM	잭슨 Immuno 연구	109-006-129
A2	돈키 F (AB ') 2 Frag 안티 - 인간 IgG (H + L)tibody	AB1	잭슨 Immuno 연구	709-006-149
A3	마우스 안티 인간 IgG F (AB ') 2 단클론 항체	AB3	잭슨 Immuno 연구	209-005-097
A4	염소 안티 인간의 알파 2 macroglobulin polyclonal 항체	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체	A1AT	리 Biosiences	CA1T-80A
A6	마우스 안티 인간 알파-1-antitrypsin 단클론 항체	A1AT	시그마 알드리치	SAB4200198
A7	토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체	주문	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	래빗 안티 인간알파-1-antichymotrypsin polyclonal 항체	주문	피셔 과학	RB9213R7
A9	마우스 안티 인간 트랜스페린 단클론 항체	트랜스페린	GeneTex	GTX101035
A10	토끼 반 인간 트랜스페린 polyclonal 항체	트랜스페린	GeneTex	GTX77130
A11	염소 안티 인간 apolipoprotein J polyclonal 항체	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체	GP73	애보트	14H4-23
A13	마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체	GP73	산타 크루즈 생명 공학 INC	SC-101275
A14	토끼 반 인간 알파-1 fetoprotein polyclonal 항체	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	마우스 안티 인간의 알파 페토 프로테인-1 단클론 항체	AFP	피츠제럴드	10-A05A
A16	마우스 안티 인간 hemopexin 단클론 항체	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
대답 17	마우스 안티 인간 glypican-3 (1G12) 단클론 항체	GPL3	산타 크루즈 바이오	SC-65443
대답 18	마우스 안티 인간 Kininogen (LMW) 단클론 항체	Kininogen	Assaypro	20333-05011
대답 19	토끼 반 인간 MMP-21 단클론 항체	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	마우스 안티 인간 CEACAM-1 단클론 antibodY	CEACAM	R & D 시스템	MAB1180
대답 21	쥐 안티 인간 DPPIV/CD26 단클론 항체	DPPIV	R & D 시스템	MAB22441
대답 22	마우스 안티 인간 PIVKA II 단클론 항체	PIVICA	크리스탈 화학	8040
대답 23	마우스 안티 carcinoembryonic 항원	CEA	미국 생물학	C1300
대답 24	마우스 방지 CA125 암 항원	CA125	미국 생물학	C0050-01D
대답 25	마우스 방지 CA19-9 암 항원	CA19-9	미국 생물학	C0075-18
대답 26	마우스 방지 루이스 X 단클론 항체	루이스 X	Calbiochem	434,631
바이오	Biotinylated BSA (긍정적인 제어)	바이오	집에서 만든	N / A

이 프로토콜에서 사용 lectins 및 항체의 표 1.리스트.

시약 S / 장비의 명칭	회사	카탈로그 번호
비 접촉 microarrayer	BioDot INC	sciFLEXARRAYER
384 microplate	어부	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray는 슬라이드	Gentel	PATH
슬라이드 Imprinter (옵션)	젤 회사	WSP60-1
흔드는 사람	어부	15-453-211
원심 분리기	Eppendorf	5804 000.013
이동식 랙과 슬라이드 씻는 세면대 / 슬라이드 염색법 요리	어부	08-812
슬라이드 배양 챔버 / 현미경 슬라이드 박스	어부	03-448-5
Brij 35, 물 30 W / V % 용액	Acros의 생명체	AC32958-0025
십대 초반-20	어부	P337-100
나트륨 Periodate (NaIO ₄₎	시그마	311,448
L-글루탐산 γ-히드라 지드	시그마	G-7257
나트륨 아세테이트 무수 (CH ₃ COONa)	시그마	S2889
소 혈청 알부민 (BSA)	Lampire 생물학 실험실	7,500,804
인산 버퍼 식염수 (PBS) (10X)	Denville 과학	CP4390-48
Dylight 549 복합 NeutrAvidin	써모	22,837
테아제 억제제 칵테일 정제	로슈	4693159001
ChromPure 인간 IgG, FC 조각	잭슨 Immunoresearch	009-000-008
ChromPure 인간 IgG, 전체 분자	잭슨 Immunoresearch	009-000-003
ChromPure 마우스 IgG, 전체 분자	잭슨 Immunoresearch	015-000-003
ChromPure 마우스 IgG, FC 조각	잭슨 Immunoresearch	015-000-008
ChromPure 토끼 IgG, 전체 분자	잭슨 Immunoresearch	011-000-003
ChromPure 돈키 IgG, 전체 분자	잭슨 Immunoresearch	017-000-003
Microarray 스캐너	Tecan	LS는 리로디드

이 프로토콜에 사용되는 장비와 시약의 표 2.리스트.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 논문에서

요약

초록

프로토콜

토론

공개 사항

감사의 글

재료

참고문헌

재인쇄 및 허가

태그

관련 논문