GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

요약

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

초록

인간 배아 줄기 세포는 (hESCs) pluripotent 및 체외 질병 모델링과 의학 ¹ 재생에 대한 소중한 휴대 소스입니다. 그것은 이전에 인간의 체세포은 4 전사 요인 자궁외 표현 (Oct4, Sox2, Klf4과 Myc)에 의해 pluripotency로 다시 프로그램 및 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs에게) ^2-4이 될 수있는 것으로 나타났습니다. hESCs 마찬가지로, 인간 iPSCs는 pluripotent과 autologous 세포에 대한 잠재적인 소스입니다. 여기 GFP 함유 retroviral 등뼈 ^네에 복제된 네 개의 프로그래밍 요소와 인간 fibroblast 세포를 재설 정할 프로토콜을 설명합니다. 다음과 같은 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간 ESC의 배양 조건 하에서 3~4주 인간 iPSCs를 생성합니다. 인간 iPSC의 식민지가 밀접한 형태의 hESCs 닮은 및 retroviral transgene의 입을의 결과로 GFP 형광의 손실을 표시합니다. iPSC의 식민지는 형광 microsco하에 기계적으로 분리PE는 hESCs과 비슷한 방식으로 동작합니다. 이러한 세포에서는 여러 pluripotency 유전자 및 표면 마커의 표현을 감지.

프로토콜

1. 프로그래밍 요소를 표현 레트로 바이러스에 의해 프로그래밍

1. 인간 섬유아 세포는 fibroblast 매체 (10 % 펜 / Strep과 DMEM에 FBS)에서 배양해 있습니다.
2. 6 - 잘 접시들이 한에 감염 전에 언젠가, 플레이트 1x10 ⁵ 인간 섬유아 세포.
3. 죽은 세포를 제거하고 신선한 fibroblast 매체 2 ML을 추가하는 매체를 기음. 5 μg / ML의 최종 농도에서 프로타민 황산염을 추가합니다.
4. 조심스럽게 감염의 다수 (방어) ⁵ 5에 해당하는 각 GFP-표현 바이러스의 적절한 금액을 추가합니다.
5. 두 ML의 fibroblast 매체를 추가 후, 어느 날 감염 후, 바이러스 표면에 뜨는을 제거 2 ML PBS로 세 번 씻는다.
6. 사흘 감염 후, GFP의 형광을 확인하고 두 ML의 fibroblast 매체와 우물을 보충.
7. 향해 fibroblast 매체에서 4 일 감염 후 접시 1x10은 조사 마우스 배아 fibroblast ⁴ / ㎝ ² (MEFs) 피더 세포10 cm 배양 접시는 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C 하룻밤 사이에 알을 품다.
8. 닷새 감염....

토론

iPSCs 내지 네 전사 요인 reprograms 인간 섬유아 세포의 표현. 많은 시도가 임상적으로 안전 iPSCs을 생성하는 비 통합 또는 비 유전자 접근 방법을 사용하여 인간 iPSCs를 생성하는 데 있었다. 지금까지 이러한 방법은 매우 낮은 효율을 보여 주며 재현성 ^{11-14 향상을} 위해 더욱 최적화가 필요합니다. 레트로 또는 lentiviral 방식은 쉽게 도출 및 바이러스성 통합으로 인한 안전 문제에 덜 의존 체외 질환 모델에서 인간에 대한 iPSCs를 적용하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 방법을 프로그래밍하는 것은 인간 iPSCs의 효율적인 유도에 사용할 수 있습니다. 인간 iPSCs의 선정은 주로 인간 ESCs 유사한 식민지의 형태에 따라 달라집니다. 더 중요한 건, 우리의 방법은 pluripotent 줄기 세포 ^7,15에 retroviral 긴 터미널 반복 (LTR)의 입을의 기능을 활용합니다. 이 프로토콜에서 사용 retroviral 벡터는 언어학에 링크.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
비필수 아미노산 (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) 또는 MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
표 1. 배양 배지
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
형광 현미경: GFP 필터가 장착된 도립 현미경
표 2. 시약 및 장비