방법 논문

콜레스테롤 유출 분석

DOI:

10.3791/3810

⸱

2012년 3월 6일

 ,  , 
1Baker IDI Heart and Diabetes Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

콜레스테롤 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도와 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 quantitate하도록 설계되었습니다. 분석은 세포 내 수영장과 세포 수용체에 콜레스테롤의 릴리스 간의 콜레스테롤 콜레스테롤, 평균으로 세포를 레이블링으로 구성되어 있습니다.

초록

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세포의 콜레스테롤 함량은 세포 세포막의 파괴, apoptosis과 괴사 1 셀 결과에 너무 많이 또는 너무 적게 콜레스테롤, 매우 빡빡 한도 내에서 유지되어야합니다. 세포는 세포 합성에서와 플라즈마 lipoproteins에서 소스 콜레스테롤, 두 소스가 완전히 콜레스테롤에 대한 세포 '요건을 충족하기 충분합니다. 콜레스테롤 합성과 이해의 프로세스를 긴밀하게 규제하고 콜레스테롤의 결함이 드문이 있습니다. 과도한 콜레스테롤은보다 일반적인 문제 3. hepatocytes의 예외와 함께 어느 정도 부신 피질 세포로, 세포는 콜레스테롤을 저하 수 없습니다. 세포는 콜레스테롤 콘텐츠를 줄이기위한 두 가지 옵션이 있습니다 또한 독성 cholesteryl 에스테르로 세포를 오버로드로 cholesteryl 에스테르, 제한된 용량과 옵션으로 콜레스테롤을 변환하고, 콜레스테롤 유출, 잠재적으로 무제한 용량과 옵션이 있습니다. 콜레스테롤 유출은 사양입니다이러한 ATP 결합 카세트 수송 단백질 A1 (ABCA1)와 G1 (ABCG1) 및 청소 수용체 타입 B1과 같은 세포내 이동 장치의 숫자에 의해 규제되고 ific 과정입니다. 혈장의 콜레스테롤의 자연 수용체가 고밀도 지단 백질 (HDL)과 apolipoprotein AI입니다.

콜레스테롤 유출 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도를 quantitate하도록 설계되었습니다. 그것은 콜레스테롤 유출 및 / 또는 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 유지하기 위해 세포의 용량을 측정합니다. 분석은 다음 단계로 구성되어 있습니다. 1 단계 : 혈청 함유 배지에 표시된 콜레스테롤을 추가하고 24-48 H에 대한 세포로 잠복기에 의해 세포의 콜레스테롤 레이블링. 이 단계는 콜레스테롤과 세포의로드와 결합할 수 있습니다. 2 단계 : 모든 세포내 콜레스테롤 풀 사이 라벨 콜레스테롤 평형 위해 혈청이없는 배지에서 세포의 배양. 이 단계는 셀룰러 채널의 활성화와 결합될 수도 있습니다olesterol의 전송기. 3 단계 : 세포 수용체와 세포의 수용체로 분류 콜레스테롤 움직임 quantitation과 세포의 배양. 콜레스테롤 엽 성의 전구 물질이 새롭게 합성된 콜레스테롤 레이블을 지정하는 데 사용한다면, 네번째 단계, 콜레스테롤 정화가 필요할 수 있습니다.

분석은 다음과 같은 정보를 제공합니다 :은 (i) 특정 치료 (돌연변이, 노크 다운, overexpression 또는 치료) 유출 콜레스테롤을 세포의 용량에 영향을 그리고 (ii) 방법 플라즈마 acceptors의 용량은 콜레스테롤을 수락하는 방법 질병이나 치료에 의해 영향을받습니다. 이 방법은 종종 심장 혈관 연구, 신진 대사 및 neurodegenerative 장애, 전염성 및 생식 질병의 컨텍스트에서 사용됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. [3 H]-콜레스테롤의 작성

  1. 연기 후드에서 1.5 ML microfuge 튜브 (0.5 잘 인당 μCi (19 kBq)은 전형적인 분석이 필요합니다)에 [3 H] 콜레스테롤 필요한 금액을 분배.
  2. [3 H]는-콜레스테롤은 톨루엔에 정지하는 경우, 1 μCi의 최종 농도 100 %의 에탄올과 N2 가스와 resuspend (물론 37 kBq / μl. 소용돌이와 혼합으로 완전히 내려 건조.

2. 도금 셀 및 Labelling 세포 콜레스테롤

인간 monocytes 4,5, THP-1 인간 단핵구-macrophages 6,7,8, RAW 264.7 murine macrophages 5,9,10,11, HELA 세포 12, 내피 인간 제대 정맥 :이 프로토콜은 다음과 같은 셀 유형을 사용하여 테스트되었습니다 혈소판의 세포 (HUVEC), BHK-21 세포 9, 인간과 마우스 섬유아 세포 13,14, HepG2 인간 hepatocarcinoma 세포 15, 수정된 형태로, <> 16 저녁을 먹다.

  1. 세포를 Resuspend 그들을 계산합니다. 0.9 ML 전체 매체에서 잘 당 0.2x10 6 세포의 최종 밀도를 12 - 웰 플레이트에 플레이트 세포. 세포는 성장을 계속하고 유출 실험 시간에 잘 당 0.8x10 6 세포에 도달할 것입니다. 이러한 차별화된 THP-1 세포와 같은 분열하지 않는 세포, 내용 시딩 밀도는 당 잘 0.8x10 6 셀이 있어야합니다. 각각 또는 24 - 잘 접시를 두 번 혹은 잘 당 세포의 절반 번호 - 6을 사용하는 경우. 우물의 숫자는 각 실험 조건에 대한 네 겹의 결정하기에 충분해야합니다.
  2. THP-1 세포의 분화가 필요한 경우, 48-72 H 위해 미디어에 PMA를 (최종 농도 0.1 μg / ml) 쇼핑 추가할 수 있습니다.
  3. [3 H] 콜레스테롤을 포함 microfuge 튜브로 미디어의 작은 나누어지는을 추가합니다.
  4. 완전한 미디어 별도 나누어지는 (100 μl / 음)에 [H 3] 콜레스테롤을 추가하기 전에 미디어와 튜브의 측면을 씻으십시오.
    5. <리> 전지 (물론 당 최종 부피 1 ML 임) 우물에 [3 H] 콜레스테롤을 포함하는 미디어를 추가합니다. 세포에 대한 치료가 라벨 전에 필요하지 않은 경우 전지는 [3 H] 콜레스테롤 함유 매체에 도금 수 있습니다.
  5. (37 ° C, 5 % CO 2) 세포 문화 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 품어.

3. 평균 보육

  1. 48시간 보육 후, 현미경으로 세포를 확인합니다. 그들은 건강과 약 80 %의 합류점에있다 확인하십시오.
  2. 미디어는 [3 H] 콜레스테롤을 포함 제거합니다. PBS로 세포를 부드럽게 씻는다. 3 세척 번 반복합니다.
  3. 혈청 프리 미디어를 준비합니다. 혈청 자유 언론, 필요한 경우, LXR의 작용제 (예 : 1-4 mMol / L에서 TO-901317) 또는 캠프 (단지 마우스 원산지 전지 0.3 μMol / L)를 추가하여 세포를 활성화합니다.
  4. 각도 500 μl 혈청 자유로운 미디어를 추가합니다.
  5. (37 ° C, 5 % CO 2) 세포 문화 인큐베이터에서 18 시간 동안 알을 품다.

4. 콜레스테롤 유출 보육

  1. 혈청이없는 배지 18 시간 배양 후 현미경으로 세포를 확인합니다. 그들이 (최소 80% confluency) 건강하고 합류있다 확인하십시오.
  2. 혈청이없는 배지에서 콜레스테롤 유출 acceptors의 솔루션을 준비합니다. acceptors의 예는 다음과 같습니다
    Apolipoprotein AI (apoA-I) (최종 농도 10 μg / ml) 쇼핑
    고밀도 지방 단백질 (HDL) (최종 농도 20 μg / ml) 쇼핑
    사이클로 덱스트린 (최종 농도 200 μg / ml) 쇼핑
    플라즈마 (최종 농도 1~2%)
  3. PBS로 세포를 부드럽게 씻는다.
  4. 각 잘으로 acceptors과 혈청이없는 미디어 250 μl를 추가합니다.
  5. 배경 유출을 (NO 수용체와 혈청 무료 미디어에 유출)를 결정 우물 한 세트를 남겨주세요
  6. 세포 문화 인큐베이터 2 시간 동안 세포를 (37 ° C, 5 % CO 2) 부화. 필요한 경우 유출 부화 기간은 30 분에서 8 H로 달라질 수 있습니다.

5. 처리 사mples

  1. 2 시간 후에 부화는 현미경으로 세포를 확인합니다.
  2. 1.5 ML의 microfuge 튜브로 미디어를 수집합니다. 세포 파편을 제거하기 위해 상온에서 1-10 분 14,000 rpm으로 봐.
  3. 7 ML의 섬광 유리병에 100 μl 미디어를 전송합니다. 5 채소 젤 플러스의 MLS (PerkinElmer)와 와동 혼합물을 추가하십시오. 4 ° C.에 남아있는 샘플을 저장
  4. 30 분 동안 냉장고에서 접시를 놓습니다. 각도 500 μl DH 2 O를 추가합니다. 모든 세포가 우물의 바닥에서 뜬했는지 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인합니다. 여전히 자기편 경우, 4 ° C에서 하룻밤이나 자국이 우물에서 DH 2 O와 접시를 떠나 하나.
  5. 모든 세포에서 찾아낸 후에는 세포 대단히 짧은 시간을 깨고 아래로 피펫합니다. 7 ML의 섬광 튜브에 100 μl를 전송합니다. 5 채소 젤 플러스의 MLS (PerkinElmer)와 와동 혼합물을 추가하십시오. 4 ° C.에 남아있는 접시를 저장
  6. 신틸레이션 계수기에 섬광 튜브를 놓습니다. [3 H]를 설명할 수에 카운터 구성DPM 단위.

6. 결과 Analysing

  1. 콜레스테롤 유출의 비율은 일반적으로 콜레스테롤의 비율이 세포의 수용체로 이동으로 표시됩니다. 다음 수식이 사용됩니다 :

figure-protocol-1

  1. 구체적인 유출은 수용체 (빈)의 유무에 유출 차이로 계산됩니다.

figure-protocol-2

7. 타임 라인

figure-protocol-3

8. 대표 결과

콜레스테롤 유출의 실험 결과의 예제는 그림에 표시됩니다. 1. 본 실험에서는 THP-1 인간 monocytes이였다 다른 acceptors로 macrophages과 콜레스테롤 유출로 차별했다테스트했습니다. 노 acceptors ( "빈")와 중간에 콜레스테롤 유출은 0.79 %이었고,이 값은 불특정 유출으로 간주되었으며, 다른 값에서 빼는되었다. 인간 apoA - 나 (최종 농도가 30 μg / ml) 쇼핑에 콜레스테롤 유출은 4.75 %였다. 참조 플라즈마 샘플을 상호 실험적 변화를 모니터링하기 위해 본 실험에 포함되었습니다. 참조 샘플은 실험 다수에 걸쳐 데이터의 정상화에 사용하지만, 우리는 변화가 클 경우 분석을 반복하는 것이 필요하다고 볼 수 있습니다. 환자는 약물로 치료되었다 전후의 환자 혈장 (최종 농도 2%)가 테스트되었습니다. 그것이 환자의 약물에 콜레스테롤 유출을 지원하는 플라즈마의 용량에 부정적인 영향을 가지고 있다고 결론했다.

유출 실험 결과의 또 다른 예제는 그림에 표시됩니다. 2. 본 실험에서는 RAW 264.7 macrophages는 LXR의 작용제 TO-901317로 하룻밤 배양 (최종 농도에 의해 활성화 또는 활성화되지 않았습니다1 μmol / L) 및 인간 플라즈마 같은 샘플 (2 %)에 콜레스테롤 유출을 테스트했습니다. 그것은 LXR의 작용제와 ABC 방송 전송기의 세포 표현의 활성화는 세포 수용체로 콜레스테롤을 공개하는 세포의 용량을 증가한다는 결론되었다.

figure-protocol-4
1 그림. 다양한 acceptors로 THP-1 세포에서 콜레스테롤 유출. ​​콜레스테롤 유출의 비율은 (즉 레이블 콜레스테롤의 비율이 세포에서 특정 수용체로 이동) 빈 값의 뺄셈 후에 표시됩니다. 평균 ± 네 겹의 결정의 SD, * P <0.05 있습니다.

figure-protocol-5
그림 2. 콜레스테롤 유출의 RAW 264.7 인간의 플라즈마에 LXR의 작용제로 활성화하거나 활성화하지. 비율 (즉, 레이블 콜레스테롤의 비율에서 콜레스테롤 유출은 세포로부터로 이동지정된 수용체)는 빈 값 뺄셈 후에 표시됩니다. 평균 ± 네 겹의 결정의 SD, * P <0.001합니다.

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토론

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콜레스테롤 유출을 측정하기위한 설명한 방법은 세포에서 세포외 콜레스테롤 수용체에 콜레스테롤의 움직임을 측정하기 위해 설계되었습니다. 이 방법론을 이해하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.

Labelling와 평균

설명한 방법론에 표시된 콜레스테롤이 혈청 함유 혈청에 추가됩니다. 자세히 조사한 적이 있지만, 그것은 콜레스테롤이 혈청 lipoproteins에 통합되고 그들이 세포에 의해 촬영되는 것으로 간주됩니다. 그것은 lipoproteins을위한 충분한 시간까지 촬영을 허용하고 콜레스테롤을위한 세포 세포막에 lipoproteins에서 이동하는 것이 중요합니다. 24 H 라벨은 충분하지만, 48 H에 대한 라벨링은 세포내 콜레스테롤 높은 구체적인 활동을 실현. 그것은 고려되어야 그 [14 C] 콜레스테롤은, (이중 라벨 실험의 예) [3 H] 콜레스테롤 대신 사용되는 구체적인 행동한다면과...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 본 연구와 관련된 어떠한 충돌하는 이익을 선언 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 빅토리아 정부의 OIS 프로그램에 의한 국민 건강과 호주의 의료 연구 협의회 (NHMRC) (526615 및 545906)에서와 일부 기금에 의해 지원되었다. DS는 NHMRC의 동료입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 \ 셀 HELA THP-1 RAW HUVEC BHK-21 HFF
전체 미디어 RPMI
- 10 % FCS
- 1퍼센트 L-글루타민
- 0.2 % 펜 strep 		M199
- 5% FCS
- 1퍼센트 L-글루타민
- 1 %의 펜 strep
- 2 %의 HEPES (1M)
- 7퍼센트 내피 세포 형성제 (ECGS) 		DMEM
- 10 % FCS
- 1퍼센트 L-글루타민
- 0.2 % 펜 strep
세럼 무료 미디어 RPMI
- 1퍼센트 L-글루타민
- 0.2 % 펜 strep 		M199
- 1퍼센트 L-글루타민
- 1 %의 펜 strep
- 2 %의 HEPES (1M)
- 7퍼센트 내피 세포 성장일 보충 (ECGS) 		DMEM
- 1퍼센트 L-글루타민
- 0.2 % 펜 strep
항로 방법 1 X 트립신 서스펜션 긁다 1 X 트립신
항로 비율 3시 10분 1시 3분 1시 20분 1시 3분 1시 3분
세포 활성화 (선택 사항) TO-901317
- LXR-작용제
- 최종 conc. 4 μm의
기타 시약 phorbol 12-myristate의 13 아세테이트 (PMA)
- 세포 분화
- 최종 conc. 0.1μg/ml

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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