콜레스테롤 유출 분석

요약

콜레스테롤 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도와 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 quantitate하도록 설계되었습니다. 분석은 세포 내 수영장과 세포 수용체에 콜레스테롤의 릴리스 간의 콜레스테롤 콜레스테롤, 평균으로 세포를 레이블링으로 구성되어 있습니다.

초록

세포의 콜레스테롤 함량은 세포 세포막의 파괴, apoptosis과 괴사 ¹ 셀 결과에 너무 많이 또는 너무 적게 콜레스테롤, 매우 빡빡 한도 내에서 유지되어야합니다. 세포는 세포 합성에서와 플라즈마 lipoproteins에서 소스 콜레스테롤, 두 소스가 완전히 콜레스테롤에 대한 세포 '요건을 충족하기 충분합니다. 콜레스테롤 합성과 이해의 프로세스를 긴밀하게 규제하고 콜레스테롤의 결함이 ^드문이 있습니다. 과도한 콜레스테롤은보다 일반적인 문제 ^3. hepatocytes의 예외와 함께 어느 정도 부신 피질 세포로, 세포는 콜레스테롤을 저하 수 없습니다. 세포는 콜레스테롤 콘텐츠를 줄이기위한 두 가지 옵션이 있습니다 또한 독성 cholesteryl 에스테르로 세포를 오버로드로 cholesteryl 에스테르, 제한된 용량과 옵션으로 콜레스테롤을 변환하고, 콜레스테롤 유출, 잠재적으로 무제한 용량과 옵션이 있습니다. 콜레스테롤 유출은 사양입니다이러한 ATP 결합 카세트 수송 단백질 A1 (ABCA1)와 G1 (ABCG1) 및 청소 수용체 타입 B1과 같은 세포내 이동 장치의 숫자에 의해 규제되고 ific 과정입니다. 혈장의 콜레스테롤의 자연 수용체가 고밀도 지단 백질 (HDL)과 apolipoprotein AI입니다.

콜레스테롤 유출 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도를 quantitate하도록 설계되었습니다. 그것은 콜레스테롤 유출 및 / 또는 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 유지하기 위해 세포의 용량을 측정합니다. 분석은 다음 단계로 구성되어 있습니다. 1 단계 : 혈청 함유 배지에 표시된 콜레스테롤을 추가하고 24-48 H에 대한 세포로 잠복기에 의해 세포의 콜레스테롤 레이블링. 이 단계는 콜레스테롤과 세포의로드와 결합할 수 있습니다. 2 단계 : 모든 세포내 콜레스테롤 풀 사이 라벨 콜레스테롤 평형 위해 혈청이없는 배지에서 세포의 배양. 이 단계는 셀룰러 채널의 활성화와 결합될 수도 있습니다olesterol의 전송기. 3 단계 : 세포 수용체와 세포의 수용체로 분류 콜레스테롤 움직임 quantitation과 세포의 배양. 콜레스테롤 엽 성의 전구 물질이 새롭게 합성된 콜레스테롤 레이블을 지정하는 데 사용한다면, 네번째 단계, 콜레스테롤 정화가 필요할 수 있습니다.

분석은 다음과 같은 정보를 제공합니다 :은 (i) 특정 치료 (돌연변이, 노크 다운, overexpression 또는 치료) 유출 콜레스테롤을 세포의 용량에 영향을 그리고 (ii) 방법 플라즈마 acceptors의 용량은 콜레스테롤을 수락하는 방법 질병이나 치료에 의해 영향을받습니다. 이 방법은 종종 심장 혈관 연구, 신진 대사 및 neurodegenerative 장애, 전염성 및 생식 질병의 컨텍스트에서 사용됩니다.

프로토콜

1. ^[3 H]-콜레스테롤의 작성

1. 연기 후드에서 1.5 ML microfuge 튜브 (0.5 잘 인당 μCi (19 kBq)은 전형적인 분석이 필요합니다)에 ^[3 H] 콜레스테롤 필요한 금액을 분배.
2. ^[3 H]는-콜레스테롤은 톨루엔에 정지하는 경우, 1 μCi의 최종 농도 100 %의 에탄올과 N2 가스와 resuspend (물론 37 kBq / μl. 소용돌이와 혼합으로 완전히 내려 건조.

2. 도금 셀 및 Labelling 세포 콜레스테롤

인간 monocytes ^4,5, THP-1 인간 단핵구-macrophages ^6,7,8, RAW 264.7 murine macrophages ^5,9,10,11, HELA 세포 ^12, 내피 인간 제대 정맥 :이 프로토콜은 다음과 같은 셀 유형을 사용하여 테스트되었습니다 혈소판의 세포 (HUVEC), BHK-21 세포 ^9, 인간과 마우스 섬유아 세포 ^13,14, HepG2 인간 hepatocarcinoma 세포 ^15,

토론

콜레스테롤 유출을 측정하기위한 설명한 방법은 세포에서 세포외 콜레스테롤 수용체에 콜레스테롤의 움직임을 측정하기 위해 설계되었습니다. 이 방법론을 이해하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.

Labelling와 평균

설명한 방법론에 표시된 콜레스테롤이 혈청 함유 혈청에 추가됩니다. 자세히 조사한 적이 있지만, 그것은 콜레스테롤이 혈청 lipoproteins에 통합되고 그들이 세포에 의해 촬영되는 것으로 간주됩니다. 그것은 lipoproteins을위한 충분한 시간까지 촬영을 허용하고 콜레스테롤을위한 세포 세포막에 lipoproteins에서 이동하는 것이 중요합니다. 24 H 라벨은 충분하지만, 48 H에 대한 라벨링은 세포내 콜레스테롤 높은 구체적인 활동을 실현. 그것은 고려되어야 그 ^[14 C] 콜레스테롤은, (이중 라벨 실험의 예) ^[3 H] 콜레스테롤 대신 사용되는 구체적인 행동한다면과.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 \ 셀	HELA	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
전체 미디어	RPMI - 10 % FCS - 1퍼센트 L-글루타민 - 0.2 % 펜 strep			M199 - 5% FCS - 1퍼센트 L-글루타민 - 1 %의 펜 strep - 2 %의 HEPES (1M) - 7퍼센트 내피 세포 형성제 (ECGS)	DMEM - 10 % FCS - 1퍼센트 L-글루타민 - 0.2 % 펜 strep
세럼 무료 미디어	RPMI - 1퍼센트 L-글루타민 - 0.2 % 펜 strep			M199 - 1퍼센트 L-글루타민 - 1 %의 펜 strep - 2 %의 HEPES (1M) - 7퍼센트 내피 세포 성장일 보충 (ECGS)	DMEM - 1퍼센트 L-글루타민 - 0.2 % 펜 strep
항로 방법	1 X 트립신	서스펜션	긁다	1 X 트립신
항로 비율	3시 10분	1시 3분		1시 20분	1시 3분	1시 3분
세포 활성화 (선택 사항)		TO-901317 - LXR-작용제 - 최종 conc. 4 μm의
기타 시약		phorbol 12-myristate의 13 아세테이트 (PMA) - 세포 분화 - 최종 conc. 0.1μg/ml