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1. 1 단계 : 마우스 배아 줄기 (MES) 세포 배양 (타이밍 : 3 일)
1. 도금 주 태아의 마우스 섬유아 세포 (PMEF)
- PMEF 부착을위한 젤라틴과 코트 넷 100-mm 조직 문화 요리. 각각의 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 (StemCell 기술) 8 ML을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어.
- 요리에서 젤라틴 초과를 제거합니다. 요리 린스하지 마십시오.
- 약 포함되어 있습니다 Mitomycin C-inactivated PMEF (Millipore) 중 하나 병을 희석. 5 X 10 6 PMEF 미디어의 40 ML로 셀 (표 1의 제조법 참조)과 네 개의 100 mm 조직 배양 요리 진입 판. PMEF는 MES 전지 피더 레이어를 제공합니다.
- PMEF는 MES 셀 문화를 추가하기 전에 적어도 하루 도금해야한다. PMEF은 도금 후 1 주일까지 사용할 수 있습니다.
2. 도금 MES 셀
모터 뉴런으로 MES 세포 분화의 효율성을 모니터링하려면우리는 HBG3, 모터 뉴런 특정 발기인 Hb9의 통제하에 eGFP을 표현 형질 전환 생쥐에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다.
- 서리를 없애다 37 ° C 물 목욕에 HBG3 MES 세포 중 1 개의 유리병 (약 1 × 10 7, 박사 더글라스 커, 존스 홉킨스 대학에 의해 기여). 15 ML 관에서 ES 미디어 (표 1에서 제조법 참조) 5 ML을 추가하고 5 분 800 rpm으로 세포를 다운 스핀.
- 10 NG / ML의 최종 농도에서 갓 추가한 백혈병 억제 인자 (난생)와 ES 미디어 20 ML의 대기음 뜨는 및 resuspend MES 세포. 참고 : 난생는 이용 당일에 추가되어야하며 undifferentiated 상태에서 MES의 세포를 유지하기 위해 필요합니다.
- 각 접시에 PMEF에서 10 ML PMEF 미디어를 제거하고 각 접시에 HBG3 ES 세포 현탁액의 10 ML에 추가합니다.
- 24 H 도금 후, MES 세포의 크기는 그림 1B에 화살촉으로 표시 식민지와 비슷한 작은 식민지를 형성하고 있습니다. 도금 후 72 H, coloni크기 일이야 증가, 많은 지름이 약 100 μm의 (그림 1B, 화살표로 표시)되고. 이러한 세포는 차별 화를위한 준비가되어 있습니다. 미디어는 세포 증식을 유지하기 위해 매일 교체해야합니다.
2. 2 단계 : 신경 유도 (타이밍 : 2 일)
모터 뉴런으로 MES 세포의 분화를 유도하기 위해 MES 전지 PMEF에서 분리 및 서스펜션 환경에서 재배해야합니다. 젤라틴 코팅 flasks는 MES 세포에서 PMEF를 구분하는 데 사용됩니다.
- MES의 식민지가 신경 유도 (차별화 당일 0으로 정의), 실온에서 30 분에 대해 0.1 % 젤라틴 (18 ML / 술병)와 코트 2 T150 flasks을위한 준비 후 초과 젤라틴을 제거하고 1X PBS 세 번 함께 씻어 때. 참고 : 각 100 mm 음식 문화는 PMEF을 분리 하나 T150-젤라틴 코팅 플라스크가 필요합니다.
- 조심스럽게 느슨하게 연결된 식민지를 이동시키다 않도록하고, 열망하여 미디어를 제거합니다. 10 ML PBS의 간단한 추가기껏해야 그리고 세차 단계를 완료하기 위해 흡인하여 제거합니다.
- PMEF에서 MES 전지를 분리하려면, 0.25 %를 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3 ML / 요리 StemCell 기술)와 37에서 3-5 분 동안 품어 ° C를 줄기 세포와 PMEF는 접시에서 분리까지. 식민지를 (15-20 번) 부수 다운 난생와 pipet 전지없이 15 ML 신선한 ES 미디어를 추가합니다. 그런 다음, 0.1 % 젤라틴 코팅 T150 플라스크에 추가할 37시 30 분 동안 품어 ° C. ES 세포가 떠 있어야하면서 부화 후 PMEF는 gelatinized 표면에 부착해야합니다. 50 ML 튜브에 떠있는 MES 세포를 수집합니다.
- (표 1에서 제조법 참조) 신경 분화 매체의 10 ML 800 RPM과 resuspend 세포에서 내려 봐.
- 100 mm 세균이나 서스펜션 배양 접시에 hemocytometer 후 접시에 약 2 × 10 6 MES 세포를 사용하여 세포를 세어보세요. 이 번호판은 서스펜션 문화의 성장을 허용하고 embryoid 기관 (EBS)의 형성을 촉진.
- differentia에서기 하루 1, MES 전지는 빛을 현미경으로 볼 수있는 작은 부동 집계 (EBS)를 형성하고 있습니다. 모든 carryover PMEF는 요리에 첨부해 주시기 바랍니다. 3 분위한 저속 (500 RPM)에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 현탁액 세포와 미디어를 전송합니다. 신중하게 미디어를 대기음, 새로운 세균 접시에 접시에 세포 후 pelleted EBS에 신선한 신경 분화 매체의 10 ML을 추가합니다. 미디어를 replenishing 이외에이 단계는 이전 단계에서 이월 어떠한 PMEF를 제거합니다.
- 차별 하루 2, EBS는 운동 뉴런에 시달릴 수도 준비가 된 것입니다.
3. 3 단계 : 모터 뉴런 사양 (타이밍 : 5 일)
- 차별 하루 2, 소용돌이 문화 접시를하고 15 ML 관으로 미디어와 EBS를 전송에. EBS 중력 (~ 10 분)에 의해 또는 3 분 저속 (500 RPM)에서 원심 분리하여 정착하자.
- (제조법을 볼에서 모터 신경 세포의 분화의 10 ML (국방부) 중간에 신중하고 resuspend EBS 미디어를 기음
- 직경 200 μm의 강력한 GFP 신호 (그림 1C)을 표현한다 - 차별화의 날 7 일에 EBS가 약 150이어야합니다. 이러한 EBS는 코팅 요리 또는 coverslips을 poly-DL-ornithine/laminin에 dissociated 및 도금이 될 준비가 된 것입니다.
4. 4 단계 : Poly-DL-ornithine/laminin 코팅 Coverslips의 작성 (타이밍 : 2 일)
이틀 EBS를 dissociating 전에 (차별화의 날 5 예), poly-DL-ornithine/laminin-coated coverslips를 준비합니다.
- 24 잘 접시의 바닥에 장소 12 mm 원형 coverslips (워너 인 스트 루먼트). 10X 주식 솔루션 (1 밀리그램 / ML)을 구하는 25 MG 25 ML의 폴리-DL-ornithine (시그마 - 올드 리치) 멸균, 이중 증류수 (D 2 H 2 O)를 해산. 때 사용할 준비 concent를 얻을 D 2 H 2 O와 폴리-DL-ornithine의 10분의 1 희석하다100 μg / ML의 배급. 하룻밤 동안 4에 24 잘 판과 부화 각각 잘 ° C에서 0.5 ML을 추가합니다.
- 다음날 (차별화의 날 6), 기음 폴리-DL-ornithine하고 조직 문화 후드에 접시와 건조 커버 전표 공기 봅시다. D 2 H 2 O를 세 번 같이 판 우물을 씻어. 한 시간 동안 공기 건조 구.
- 100x 주식 용액 (200 μg / ML)를 만들기 위해 아이스처럼 차가운 1X PBS의 5 ML에 1 밀리그램 마우스 laminin (Millipore)를 해산. 때 사용할 준비 아이스처럼 차가운 1X PBS (2 μg laminin / ML)의 100분의 1 희석을합니다. 0.5 ML 추가 / 음 4 24 잘 판과 부화에 ° C에서 하룻밤을위한. 시딩 세포하기 전에 과잉 laminin은 제거하고 우물은 1X PBS로 두 번 씻어서해야합니다. Coverslips은 국방부 중형 (0.5 ML / 음)에 저장할 수 있습니다.
5. 5 단계 : 축삭의 신장 (타이밍 : 2 일)
- 차별화의 날 7 일에 15 ML 관으로 EBS를 수집하고 EBS가 (약 3 분) 정착하실 수 있습니다. 기음 미디어와 다시의PBS의 uspend EBS. EBS가 정착 후 PBS를 대기음하도록 허용합니다. 이 단계를 3 번씩 반복합니다. 부드럽게 믹스 앤 실온에서 5 분 동안 품어, EBS에 Accumax (Millipore) 1 ML을 추가합니다. 그렇다면 EBS를 덮고 초과 Accumax을 기음.
- EBS를 떼어 놓다하려면 국방부 매체 3 ML을 추가합니다. EBS를 방해하는 한 ML Eppendorf micropipette (파란색 팁)을 사용 Pipet 위아래로 20 회. 상온에서 2 분 동안 품어. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너 뚜껑 (BD 팔콘)로 12x75 mm 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 단일 세포의 수율을 풍요롭게하는만큼 필터에 의해 보관 남은 대단히 짧은 시간과 세포이 분리 단계를 반복합니다. 최종 단일 세포 현탁액 6 ML 될 것입니다.
- 살살이 단일 세포 현탁액을 혼합하고 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. ML 당 2x10 5 세포 밀도에 국방부 매체 (10 각 BDNF의 NG / ML, GDNF, CNTF, 및 NT-3과 보충)로 세포를 희석. PO를 포함하는 24도 접시에 세포 현탁액을 (0.5 ML / 잘) 추가ly-DL-ornithine/laminin 코팅 coverslips (위에서 설명한대로 이전 준비). 차별화된 세포는 문화 2 일 (그림 1D) 이후 오랜 neurites을 확장.
6. 대표 결과
그림 1A는 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 1 단계에서 MES 전지 PMEF에서 재배되며 자발적인 차별을 방지하기 위해 난생으로 보충. 일반적으로 undifferentiated MES의 식민지는 원형 및 소형이고, 명확하게 가장자리를 정의했습니다. 식민지는 서로 연락을하지 않습니다. 일반적으로, MES 세포는 매 2 ~ 3 일 1시 4분 비율로 분할해야합니다. 그러나 각 개별 셀 라인은 서로 다른 속도로 성장할 것이며, 분할 비율은 경험적으로 결정되어야합니다. 그림 1B에있는 화살표는 3 일 동안 PMEF 피더 계층에 culturing 후 MES 세포의 전형적인 모양을 나타냅니다. 이러한 식민지가 큰 (직경 50-100 μm의)하지만, 여전히 원형과 정의 우위를 유지의. 이 단계에서는 식민지는 차별이나 subculture에 대한 준비가되어 있습니다. 그림 1B의 화살촉은 일반적으로 도금 후 24 H를 찾을 수있는 작은 MES들의 서식지를 보여줍니다. 도금 후 4 일이, MES 전지는 크게 자란된다. 그들은 차별화하기 시작되었는지 나타내는 평평 외관 및 정의된 경계의 손실을 보여줍니다. 이러한 세포의 연결을 세포로 분화에는 최적화되어 있지 않습니다.
모터 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기 위해 MES 전지 EB 형성을 허용하도록 서스펜션 조건에서 재배해야합니다. 2 단계에서 ES 세포는 EB 형성을 촉진하기위한 피더 레이어없이 문화 표면에 전송됩니다. 이 단계에서 그들은 신경 혈통에 대한 직접적인 세포 ~ 2 일 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8과 보충 신경 분화 매체에 incubated됩니다. 작은 EBS는 차별화의 일 1시 현미경으로 관찰할 수있다. 그들은 중간에 떠 있어야합니다. Carryover PMEF는 1 일에서 찾을 수 있습니다분화 및 제거해야합니다. 이러한 세포는 EBS가 새로운 세균 접시에 passaged 때 이렇게 제거되는 세균 요리에 충실. 따라서 분화의 일 2에 의해 몇 없거나 전혀 PMEF가 문화 접시에 볼 수 있습니다. 3 단계에서 새로운 요리에 대한 EBS의 양도 어느 남아 PMEF의 제거를 보장해야 계속했다. EBS가 RA로 보충 모터 신경 세포의 분화 (국방부) 미디어 배양해 및 모터 뉴런으로 세포를 차별화하는 데 5 일째 처짐됩니다. 문화 동안 EBS 크기가 계속해서 성장과 분화의 날 3시 육안으로 볼 수 있습니다 ~ 4. 그림 1C는 차별화 당일 7 EBS의 미세한 모양을 보여줍니다. undifferentiated 세포와는 달리, EBS는 GFP의 표현으로 인해 강한 형광을 보여줍니다. 이러한 EBS는 최적 차별하고 분열을위한 준비가되어 있습니다. 유동세포계측법 51 % ± dissociated EBS에서 세포의 0.8 %는 세포에게 5 표현 GFP로 구분 것을 보여주었다. 단계 5 회 문화에GDNF, CNTF, BDNF, 그리고 긴 axonal 계획안의 확장 NT3 결과의 앞에서 ESE 모터 뉴런 있습니다. 그림 1D 2 일 dissociated EBS의 도금 후 차별화된 세포의 모양을 보여줍니다. 도금 세포 세포 기관에서 연장 긴 neurites를 적어 둡니다. Immunofluorescent 염색법은 GFP + 세포가 팬 -의 연결 마커 (neurofilament - 중간 체인) 두 개의 모터 뉴런 특정 마커 (섬-1과 콜린 acetyltransferase, 그림 2)을 표현하는 것을 보여줍니다.
그림 1. 모터 뉴런 (사진 우 외에서 수정했습니다. 5)으로 MES 세포의 분화. MES 세포에서 모터 뉴런으로 분화 프로토콜의) 제도. B) Undifferentiated MES 세포는 fibroblast 피더 레이어의 상단에 둥근 식민지를 형성하고 있습니다. 그들은 약한 GFP 식을 있습니다. C) MES 전지는 피더 레이어와 cultu에서 분리되었다EBS를 형성 낮은 첨부 요리에 빨강. 분화 과정의 첫 두 일 동안 세포 50 NG / ML의 소량, 20 NG / ML bFGF, 20 NG / ML FGF-8에 노출되었다. 그 후, 그들은 1 μm의 retinoic 산성, 5 일 동안 1 μm의 소닉 고슴도치 작용제의 처지와 차별화하는 유도했다. 차별화된 MES 전지는 강한 GFP의 형광을 표명했다. D) 7 일간 분화 후, EBS는 poly-DL-ornithine/laminin 코팅 접시에 dissociated 및 도금했다. 차별화된 세포는 문화의 2 일 후에 긴 신경 프로세스를 확장. 스케일 막대 = 200 μm의. 미네소타 = 모터 신경 세포. B, C와 D는 명시야 이미지이며, B ', C'와 D '에 해당하는 형광 이미지입니다.
그림 2. MES 셀 - 파생 모터 뉴런의 특성화. neurofilament 매체 체인 (NF-M, 빨강), 채팅 (적색), 그리고 섬-1 (빨간색)에 대한 Immunofluorescence 염색법은 GFP (녹색) expr과 일치했습니다ession. DAPI는 (파란색) 핵을 식별하는 데 사용되었다. 스케일 막대 = 50 μm의.