단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포의 고도로 전문화된지만, 상당히 작고 인구는 많은 조직에서 중요한 역할을 재생합니다. 극히 드문 셀 하위 집합에 대한 셀 타입의 특정 마커와 유전자 발현 프로그램의 식별은 표준 전체 - 조직 접근법을 사용하여 도전하고있다. 개별 세포의 유전자 발현 프로 파일링은 전체 조직을 1-7의 단지 작은 백분율을 구성하는 세포 유형에 대한 전례없는 접근을 허용합니다. 또한,이 기법은 transiently 역동적인 발달 전환 8시 세포의 작은 숫자로 표현되는 유전자 발현 프로그램을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
세포의 다양성이 문제의 연결을 연결 9 상당히 다양한 세포 사이에 발생할 수있는 중추 신경계 (CNS)에 반복적으로 발생합니다. 서로 다른 세포 유형의 정확한 숫자는 정확하게 알려져 있지 않지만 그것은 내가 피질에있는 많은 1000 가지 종류가있을 수 있다고 추산되었습니다tself 10. 복잡한 신경 회로의 기능 (들)은 희귀의 연결 유형과 그들이 표현하는 유전자의 일부에 의존하고 있습니다. 새로운 마커를 확인하고 molecularly 다른 뉴런을 분류하는 데 도움함으로써 단일 셀 접근 방식은 신경계의 세포 유형의 분석에 특히 유용합니다. 그것은 또한의 연결을 시조 개발의 초기 단계 동안 differentially 표현 유전자와 유전자 경로를 식별하여 신경 발달의 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.
상당한 다양성의 연결을 가진 간단하고 쉽게 접근할 조직으로 척추 망막 세포 발달의 연결을 분화하고의 연결을 다변화의 과정을 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그러나 CNS의 다른 부분에서와 같이,이 세포 다양성로드 photoreceptors가 교장 이루는 것을 특히 주어진 특정 세포의 운명을 채택 망막 progenitors을 유발 유전자 경로를 결정하는 문제를 제시할 수총 망막 세포 인구 11 jority. 여기 하나의 망막 세포 (그림 1)로 표현 성적표의 확인에 대한 방법을보고합니다. 단일 세포 프로 파일링 기술은 망막 2,4,5,12의 다양한 세포 인구 내에서 이질 선물의 금액의 평가를 허용합니다. 또한,이 방법은 세포의 운명은 망막 전구 세포의 하위 집합 8에서 발생하는 프로세스를 의사 결정에 역할 (들)을 재생할 수 있습니다 새로운 후보 유전자의 호스트를 발표했다. 프로토콜에 대한 간단한 조정으로이 기법은 여러 조직과 세포 유형에 활용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 세포 분리
- 표시되는 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1입니다. 이 프로토콜에 걸쳐 사용되는 특정 시약의 카탈로그 번호를 보려면 표 1을 참조하십시오. PBS 목욕의 망막 해부. 해부 동안, 그것은 망막이 분리에 방해가 있습니다 그들을 지키는 이후 유리체와 렌즈를 제거하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 망막 색소 상피 (RPE)를 모두 제거하고 어떤 경우에 완전히 그것을 제거하는 것은 불가능 수 있습니다 항상 매우 중요하지 않습니다. 그러나 photoreceptors의 단일 세포 프로 파일링 실험, RPE은 제거되어야합니다. RPE를 제거하지 않으면 RPE 표현된 유전자와로드 셀 프로필 오염으로 이어질 수 있습니다. 이것은 아마도 photoreceptors와 RPE 사이의 연결에 의한 것입니다.
분리의 경우 전체 성인 murine 망막는 20를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 37 ° C에서 incubated있다μl 활성화된 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 μl 25 밀리미터 시스테인, 그리고 360 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS가) 10 MM HEPES와 보충. 필터 - 스쳐 피펫 팁은 잠재적인 오염을 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
연구를 계속 확장하는 숫자는 그들의 유전자 발현 6,8에 관한 더 균질로 생각되었다 인구에 강력한 휴대 전화의 변화를 공개하고 있습니다. 적어도 하나의 인스턴스에서이 유전자 발현 "노이즈"가 중요한 생물 학적 기능 13 재생을 보여줘왔다. 개별 세포 간의 유전자 발현 차이는 전통적인 전체 - 조직 방법을 사용하여 왜곡하고 있습니다. 이러한 실험 대표 14되지 않을 수 있습니다 "일반적인"세포의 표현 프로필을 생성합니다. 여기 하나의 망막 세포에서 유전자 발현 패턴의 분리 및 확인에 대한 방법을 제시한다. 개별 세포의 연구는 연구자들이 다양한 세포 유형의 독특한 유전자 발현 패턴을 결정하는 중요 복잡한 조직의 기본 세포 이질을 알아내기 수 있습니다. 또한 단일 셀 격리 indiv의 활동을 주도 유전자 프로그램에 대한 통찰력을 제공할 수개발에 걸쳐 시간 지점에서 idual 세포. 복잡한 셀룰러 네트워크의 기능이 드문 세포 유형의 독특한 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
참고문헌
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expre....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
