방법 논문

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

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⸱

DOI:

10.3791/3824

⸱

2012년 4월 19일

 , 
1Department of Genetics, Development and Cell Biology, Neuroscience Program, Iowa State University

이 논문에서

요약

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

초록

세포의 고도로 전문화된지만, 상당히 작고 인구는 많은 조직에서 중요한 역할을 재생합니다. 극히 드문 셀 하위 집합에 대한 셀 타입의 특정 마커와 유전자 발현 프로그램의 식별은 표준 전체 - 조직 접근법을 사용하여 도전하고있다. 개별 세포의 유전자 발현 프로 파일링은 전체 조직을 1-7의 단지 작은 백분율을 구성하는 세포 유형에 대한 전례없는 접근을 허용합니다. 또한,이 기법은 transiently 역동적인 발달 전환 8시 세포의 작은 숫자로 표현되는 유전자 발현 프로그램을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

세포의 다양성이 문제의 연결을 연결 9 상당히 다양한 세포 사이에 발생할 수있는 중추 신경계 (CNS)에 반복적으로 발생합니다. 서로 다른 세포 유형의 정확한 숫자는 정확하게 알려져 있지 않지만 그것은 내가 피질에있는 많은 1000 가지 종류가있을 수 있다고 추산되었습니다tself 10. 복잡한 신경 회로의 기능 (들)은 희귀의 연결 유형과 그들이 표현하는 유전자의 일부에 의존하고 있습니다. 새로운 마커를 확인하고 molecularly 다른 뉴런을 분류하는 데 도움함으로써 단일 셀 접근 방식은 신경계의 세포 유형의 분석에 특히 유용합니다. 그것은 또한의 연결을 시조 개발의 초기 단계 동안 differentially 표현 유전자와 유전자 경로를 식별하여 신경 발달의 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

상당한 다양성의 연결을 가진 간단하고 쉽게 접근할 조직으로 척추 망막 세포 발달의 연결을 분화하고의 연결을 다변화의 과정을 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그러나 CNS의 다른 부분에서와 같이,이 세포 다양성로드 photoreceptors가 교장 이루는 것을 특히 주어진 특정 세포의 운명을 채택 망막 progenitors을 유발 유전자 경로를 결정하는 문제를 제시할 수총 망막 세포 인구 11 jority. 여기 하나의 망막 세포 (그림 1)로 표현 성적표의 확인에 대한 방법을보고합니다. 단일 세포 프로 파일링 기술은 망막 2,4,5,12의 다양한 세포 인구 내에서 이질 선물의 금액의 평가를 허용합니다. 또한,이 방법은 세포의 운명은 망막 전구 세포의 하위 집합 8에서 발생하는 프로세스를 의사 결정에 ​​역할 (들)을 재생할 수 있습니다 새로운 후보 유전자의 호스트를 발표했다. 프로토콜에 대한 간단한 조정으로이 기법은 여러 조직과 세포 유형에 활용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 분리

  1. 표시되는 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1입니다. 이 프로토콜에 걸쳐 사용되는 특정 시약의 카탈로그 번호를 보려면 표 1을 참조하십시오. PBS 목욕의 망막 해부. 해부 동안, 그것은 망막이 분리에 방해가 있습니다 그들을 지키는 이후 유리체와 렌즈를 제거하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 망막 색소 상피 (RPE)를 모두 제거하고 어떤 경우에 완전히 그것을 제거하는 것은 불가능 수 있습니다 항상 매우 중요하지 않습니다. 그러나 photoreceptors의 단일 세포 프로 파일링 실험, RPE은 제거되어야합니다. RPE를 제거하지 않으면 RPE 표현된 유전자와로드 셀 프로필 오염으로 이어질 수 있습니다. 이것은 아마도 photoreceptors와 RPE 사이의 연결에 의한 것입니다.
    분리의 경우 전체 성인 murine 망막는 20를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 37 ° C에서 incubated있다μl 활성화된 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 μl 25 밀리미터 시스테인, 그리고 360 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS가) 10 MM HEPES와 보충. 필터 - 스쳐 피펫 팁은 잠재적인 오염을 최소화하기위한 프로토콜의 모든 단계에 사용됩니다. papain 농도과 부화의 시간은 연령과 조직의 특성에 따라 달라집니다. 예를 들어 출생 후의 일 0 (P0)에서 격리 망막을 개발 해리 위해, 10 μl 활성 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μl 25 밀리미터 시스테인 및 10 밀리미터 HEPES과 보충 380 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 망막을 품어 37 ° C. 10 분 여러 종의 망막은 또한 약간 다른 조건이 필요합니다. 치킨 망막 개발의 대부분 단계에 마우스 망막보다 얇은 있습니다. 10 μl 활성화된 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μl 25 밀리미터 시스테인, 37시 5 분 10 밀리미터 HEPES과 보충 380 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) ° C를 사용하여 T를 떼어 놓다 충분hese 망막.
  2. 부드럽게 어떠한 정착 세포를 이동시키다하는 튜브를 누르 다음, P1000 pipettor으로 부드럽게 평균의 10 배에서 20 배를 씹다. 37시 추가로 10 분 동안 품어 ° C에서 조직의 크고 대단히 짧은 시간이 평균의 10 배에서 20 배를를 지속하고 다시 씹다 경우.
  3. DNase I (10 U / μl) 5 μl을 넣고 실온에서 5 분 동안 품어. P1000 pipettor으로 부드럽게 가루로 빻다. 시간의 정확한 숫자는 경험적으로 판단해야하지만, 일반적으로 10-20 사이에 떨어지는 것입니다.
  4. 3 분위한 3,000 rpm으로 테이블 탑 원심 분리기에서 원심 분리기 하단에 액체 100-200 μl를 떠나, 표면에 뜨는을 제거하고 펠릿 꺼내려 튜브를 누릅니다. HBSS 1 ML을 추가하고 부드러운 분쇄와 펠렛을 resuspend. 튜브를 대는 건 단순히 망막 세포의 많은 lyse와 펠렛을 resuspending 여기있는 것이 중요합니다. 이것은 성인 murine 망막과 특히 그렇습니다.
  5. 3 분위한 3,000 rpm으로 원심 조심스럽게 포함하는 PBS의 450 μl에 뜨는 및 resuspend를 제거ING 0.1 % BSA. 그것은 미래에 반응을 억제 수도 분리의 lysed 세포 및 기타 제품에서 mRNAs의 존재를 최소화하기 위해 가능한 한 많이 뜨는의를 제거하는 것이 중요합니다.

2. 단일 세포를 수확

  1. 0.1 % BSA와 보충 PBS의 5 ML 담긴 두개 6cm 요리를 준비합니다. 플레이트는 dissociated 한 접시 진입 세포와 세포가 적어도 5 분 동안 정착하실 수 있습니다. 사용되는 셀 밀도는 프로필에 단일 세포의 특성에 크게 의존합니다. 예를 들어, 형광 마커와 같은 GFP와 라​​벨이 매우 드문 세포에 대해, 전체 dissociated 망막은 단일 6cm 요리에 도금하고 있습니다. 약간 더 풍부 세포 들어, 적은 수의 세포가 처음보다 쉽게​​ 첫 micropipette 하나의 (혹은 것과 아주 가까운) 전지를 꺼낼 수 있도록 도금있다.
  2. 거꾸로 현미경에 dissociated 세포의 접시를 놓습니다. 우리는 올림푸스에서 IMT-2 모델을 사용합니다. 좋로 그려진되었습니다 micropipettes 사용함께 흡인기 튜브와 NE 팁 (내경 0.5 mm, 외경 1.04 ㎜) (그림 2)는 단일 세포를 수확. 세포는 쉽게 그것을 접시에 접근해서 배치됩니다 micropipette를 입력합니다. 이것은 흡인기 튜브가 거꾸로 현미경 (우리가 거​​꾸로 현미경과 함께 사용 흡인기 튜브 38.1 cm 오래입니다)과 관련된 무대도 너무 오래하거나 거리가 너무 짧은 것이 중요합니다. 튜브가 너무 긴 경우 세포는 회수 관에 micropipette에서 효율적으로 추방되지 않을 수 있습니다. 우리가 나이가 IMT-2 모델 거꾸로 현미경을 사용하는 주된 이유는 우리가 우리 흡인기 조립 튜브의 무대로 이상적인 거리를 가지고 발견한다는 것입니다. micropipette를 입력한 후 셀 (또는 셀)은 하나 하나의 세포가 유전자 발현 프로 파일링을위한 수확되도록 두 번째 접시 (세척 접시)에 퇴학하고 있습니다. 두 번째 접시에 역시 새로운 micropipette과 관계없는 세포를 제거하는 종종 필요하다혹은 단지 하나의 세포 micropipette를 입력 있도록 다른 위치로 관심 셀을 이동합니다.
  3. 개별 셀을 완전히 인접 세포로부터 분리되면, 섹션 2.2에서와 같이 관심 셀 대기음하는 새로운 micropipette를 사용하고 4.5 μl 세포 용해 완충액을 포함한 0.2 ML PCR 튜브에 직접 퇴학. 세포는 튜브로 micropipette의 팁을 끊다 않도록주의되는 튜브의 측면에 퇴학하고 있습니다. 샘플은 용해 버퍼에 세포를 담가 위해 벤치 위로 microcentrifuge로 간단히 냈지 수 있습니다. 이 회전은 보통 단세포 고립의 기간 동안 얼음에 보관해야합니다 모든 다섯째 세포 후 다음 다시 용해 버퍼에 단일 세포를 포함하는 collection.Tubes 끝에 이루어집니다. 최적의 결과를 얻으려면 하나의 세포는 두 시간 창 사후 분해 내에 저장됩니다. 이번 경과 후 추가적인 시간이 observ 걸렸고 그것은 반대로 전사 단계로 진행하는 것이 가장 좋습니다에드는 RNA 저하의 가능성을 높일 수 있습니다.

3. 스크립트 작성을 역방향

  1. 간단히 모두 하나의 세포가 세포 용해 완충액에 열중하고 보장하기 위해 benchtop minicentrifuge에서 샘플을 돌리다. 세포 용해를 촉진하기 위해 90 초 동안 70 ° C에서 샘플을 품어. thermocycler 인치 즉시 다시 얼음 튜브를 넣습니다.
  2. 2 분 동안 얼음 튜브를 남겨주세요. 모든 시약의 첨가의 경우 오염을 방지하기 위해 필터 팁 피펫 팁을 사용합니다. 반대로 전사를 수행하려면 0.33 μl 윗첨자 III (200 U / μl), 0.05 μl RNase 억제제 (40 U / μl) 및 0.07 μl T4 유전자 32 단백질을 추가합니다. 50시 50 분 ° C ~ thermocycler에 대해 반응 혼합물을 품어. 얼음에 15 분 장소 70시 효소 °​​ C를 Inactivate.
  3. 무료 뇌관을 제거하려면, 0.1 μl Exonuclease 버퍼 (10X), 0.8 μl DH 2 0 (분자 생물학 등급) 및 0.1 μl Exonuclease를 추가 I (20 U / μl). 30 분 동안 37 ° C에서 부화thermocycler. 25 분 동안 80 ° C에서 반응을 잠복기 후 얼음에 튜브를 삽입하여 효소를 Inactivate.

4. PCR을 미행하고 단일 셀

  1. 미행 반응 혼합물 6 μl을 넣고 10 분 동안 20 분, 70 ° C에 대해 37 ° C에서 샘플을 부화 thermocycler를 사용하여, 4 시에 개최 ° C
  2. PCR 반응 혼합물에 꼬리 시료 10 μl를 추가하고 다음과 같은 조건을 사용하여 두 번째 가닥 합성과 PCR 증폭을 수행합니다 :
    1. 2 분 95 ° C
    2. 5 분에 대해 37 ° C
    3. 16 분 72 ° C
    4. 40 초위한 93 ° C
    5. 1 분에 대해 67 ° C
    6. 사이클 당 6 초 추가 6 분 72 ° C,
    7. 4 34 번 단계로 이동
    8. 10 분 72 ° C
    9. 4에서 멈춰 ° C

5. Affymetrix 칩 레이블링

  1. cDNA의 라벨 10-20 μg (증폭된 cDNA 결과의 농도단일 세포에서 ING는 일반적으로 Affymetrix의 microarrays에 대한 강력한 하이브 리다이 제이션을 얻기 위해) 1 μg / μl를 낙제야있다. 첫째, 조각 μl 80에 8 μl 1X 원 Phor - 모든 버퍼와 희석 1 μl (1X에서 1시 10분 원 Phor - 모든 버퍼) DNaseI로 단일 셀 cDNA의 10-20 μl를 추가하여 cDNA 반응. 37시 13 분 대한 thermocycler에 품어 ° C. 100 ° C와 얼음의 장소에 15 분 동안 DNase I을 Inactivate.
  2. 20 μl 5 배 가열 치사 시간 버퍼, 2.5 μl 비오틴 N6-ddATP (엔조 Biosciences), 1 μl 가열 치사 시간을 (가열 치사 시간 버퍼에 1시 8분 희석) 추가합니다.
  3. 65 후 5 분 ° C., 37 ° C에서 90 분 동안 품어 -20 ° C에서 상점 또는 Affymetrix microarray 즉시 잡종. 하이브 리다이 제이션은 표준 Affymetrix 프로토콜을 사용하여 수행됩니다.

6. 대표 결과

cDNA 샘플의 cDNA, 10 μl의 품질을 평가하는 것은 1 % 아가로 오스 겔에로드되었습니다. cDNA는 주로 (500-2000 BP) 크기의 범위에 의해 규정되는cDNA 비방 및 강도 (그림 1 및 그림 3A). 그림 1에 묘사된 겔에서 다른 모든 차선은 망막 세포로부터 cDNA 얼룩이 E16.5을 분리 보여줍니다. 전용 미디어가 바늘로 aspirated과 PCR 튜브로 입금되면 차선이 사이에 발생하는 얼룩을 보여줍니다. 이러한 차선은 희미한 얼​​룩을 완벽하게 찾아볼 수없는 절대 아니지만 유전자 특정 PCR의 primers가 그들의 유전자를 증폭하는 데 사용되는 때 그들은 어떤 결과를 표시하지 않습니다. 또한 cDNA 비방의 강도는 (그림 1 및 그림 3a를 비교) 다소 다를 수 있습니다. 차선은 B, C, D, 전자 상당히 덜 견고한있는 동안 그림 3A의 차선에서, F, G와 H는 강력한 cDNA 얼룩을 포함합니다.

유전자 특정 PCR은 하나의 세포로부터 cDNA의 품질의 보조 화면으로 사용됩니다. 그림 3의 cDNAs는 형광등 망막 신경절 세포를 격리 그리고 그들은 teste 었죠d는 망막 신경절 세포 마커 Brn3b 및 Pax6위한 PCR의 primers를 사용하여. 이 분석은 cDNA 1 μl 30주기위한 PCR를 받게되었다. 실시간 정량 PCR은 바람직 검정 될하지만 prohibitively 고가이어야하며 단지 cDNA 품질을 평가하기위한 필요하지 않습니다 있습니다. 단일 세포의 모든 8 Pax6 (그림 3B) 8 아웃 Brn3b 및 6에 양성. 심지어 cDNA Brn3b 및 Pax6위한 생산 밴드 덜 견고했다 얼룩. 이러한 PCR 결과에도 불구하고, 이건 정말 차선 B, C, D 및 E에서와 같이 cDNA 나왔는 Affymetrix 배열에 강력한 hybridizations을 양보하지 않으며 일반적으로 피해야하는 우리의 경험이다. photoreceptor 마커 Crx위한 유전자 특정 PCR은 단세포 cDNAs (그림 3B)의 오염 수준을 결정하는 데 사용되었다. 이러한 세포 따라서 망막의 대부분 (~ 70 %) 메이크업하고 있기 때문에 photoreceptor 표지가 선정되었다 발생한 세포 용해는 대부분 막대 photore을 수반ceptors. Crx 선물의 희미한 금액도 PCR의 30 사이클 이후에 이러한 cDNA 준비에만 발생했습니다. 마지막으로,이 PCR 기반 화면 cDNAs가 전체 microarray 프로 파일링에게 쓰는 전에에서 파생되었다 특정한 세포 유형의 어떤 하위 집합 결정하기 시작하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은이 과정에서 가장 비싼 단계로 프로파일되는 세포의 우선 순위를하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 유전자 Tachykinin1 (그림 3B)의 존재 그들을 상영하여 망막 신경절 세포의 일부가 확인되었습니다.

작은 PCR 기반의 화면에서 특정 단일 세포는 선택과 cDNAs은 Affymetrix microarray에 hybridized됩니다. microarray 데이터 비교 및​​ 패턴은 표준 클러스터링 알고리즘을 사용하여 발견 할 수 있습니다. 같은 그림 4에서와 같이 Heatmaps는, 그래픽 데이터를 표현하기 위해 생성됩니다. 그림에서 단일 세포 프로 파일링 데이터와 관련된 두 가지 주요 결론이 있습니다4. 단세포 프로토콜을 수행한 후에는 먼저, 특정 세포 유형으로 표현 유전자는 해당 셀 유형에서 거의 독점적으로 발견된다. 한 셀 타입의 마커 유전자는 바이폴라 세포가 두 번째 셀 타입에서이 표현은 쉽게 원위치에 하나에 의해 확인되어, 낮은 수준의 일부 "로드"유전자를 표현하는 등 관찰과 같은 두 번째 셀 타입, 또한 발견되는 대부분의 경우에서 하이브 리다이 제이션이나 항체 염색법. 둘째, 다양 amacrine와 신경절 세포 프로파일 내에서 유전자 발현의 이질 즉시 명백한 것입니다. Nr4a2 및 Scube2 다른 amacrine 세포 heterogeneously 표현 유전자의 두 예입 동안 Pou4f1는, 개발 신경절 세포 1 / 4 정도 표시됩니다. 수백 개의 유전자가 개발 신경절 세포의 마커로서 혹은 2,4 amacrine 세포의 다양한 인구의 마커로서 식별 및 확인되었습니다대로 실제로, 히트맵에 표시된 유전자는 작은 샘플입니다.

figure-protocol-1
1 그림. 단일 세포 프로 파일링 방법의 흐름도. 우선 망막는 고립된 papain을 사용하여 각각의 세포에 dissociated 있습니다. 둘째, 단일 세포 뽑아 유리 바늘로 채취 및 PCR 튜브로 입금됩니다. 세포 lysed 및 cDNA는 PCR 다음에 역방향 전사를 사용하여 증폭하고 있습니다. 결과 cDNA 품질 등의 표시 것과 아가로 오스 겔에서 평가됩니다. 첫 번째 차선의 DNA를 사다리 후 차선 미디어 컨트롤에서 증폭 제품과 번갈아 단일 세포 (빨강 괄호로 표시)에서 cDNA 얼룩을 보여줍니다. 이러한 품질 (적색 브래킷)의 번진 자국은 Affymetrix의 microarrays에 hybridized됩니다.

figure-protocol-2
그림 2. 바늘 및 흡인기 튜브 어셈블리의 사진. 단일 세포의 모세관을 사용하여 절연하고유리 micropipette을 (내경 0.5 mm, 외경 1.04 ㎜) 당겼고, 흡인기로 불어의 압박에 의해 전송됩니다. 이것은 흡인기 튜브가 모두 긴 쉽게 조작할 수있을만큼 안정적으로 개별 세포를 배출 정도로 짧은 것이 중요합니다. 바늘로 뽑았 모세관 튜브의 클로즈업 전망 B.에 나와 있습니다

figure-protocol-3
그림 3. 단세포 cDNA 나왔 및 유전자 특정 PCRs의 대표 예. 증폭 후 cDNA 단일 세포의 품질을 확인하려면, 각각 하나의 세포 샘플의 10 μl는 부정적인 컨트롤 ()와 함께 1 % 아가로 오스 겔에서 실행되었다. 얼룩은 500-2000 BP 사이에 나타납니다. 특정 유전자에 대한 추가 PCR 기반의 심사를 식별 / 격리되었다 세포의 종류와 샘플의 오염 선물의 양을 (B)를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 망막 신경절 세포에 대한 특정 Primers는 Brn3b를 마커그리고 Pax6은 이러한 세포 (행 1 및 2)의 신원을 확인하는 테스트되었습니다. 준비 photoreceptor 오염의 양을 평가하기 위해 photoreceptor 마커 Crx 특정 primers는 (행 3) 사용되었습니다. 신경절 세포의 하위 집합은 또 Tachykinin1 (행 4)와 같은 마커에 대한 심사를 통해 확인할 수 있습니다.

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4 그림. 마커 유전자의 단일 세포 표현식은. 22 별개의 단일 세포로 표현 선택된 유전자의 microarray 결과 히트맵 형식으로 표시됩니다. microarray 신호의 농도는 붉은 색의 강도와 일치하도록 조정되었습니다. 블랙 microarray에 대한 신호의 부재를 나타냅니다. 다른 세포는 성인 망막으로부터 격리하는 동안 표시되는 망막 신경절 세포 (RGC) 엽 성의 전구 물질은 배아 시간 지점에서 고립되었다.

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토론

연구를 계속 확장하는 숫자는 그들의 유전자 발현 6,8에 관한 더 균질로 생각되었다 인구에 강력한 휴대 전화의 변화를 공개하고 있습니다. 적어도 하나의 인스턴스에서이 유전자 발현 "노이즈"가 중요한 생물 학적 기능 13 재생을 보여줘왔다. 개별 세포 간의 유전자 발현 차이는 전통적인 전체 - 조직 방법을 사용하여 왜곡하고 있습니다. 이러한 실험 대표 14되지 않을 수 있습니다 "일반적인"세포의 표현 프로필을 생성합니다. 여기 하나의 망막 세포에서 유전자 발현 패턴의 분리 및 확인에 대한 방법을 제시한다. 개별 세포의 연구는 연구자들이 다양한 세포 유형의 독특한 유전자 발현 패턴을 결정하는 중요 복잡한 조직의 기본 세포 이질을 알아내기 수 있습니다. 또한 단일 셀 격리 indiv의 활동을 주도 유전자 프로그램에 대한 통찰력을 제공할 수개발에 걸쳐 시간 지점에서 idual 세포. 복잡한 셀룰러 네트워크의 기능이 드문 세포 유형의 독특한 ...

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공개 사항

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