방법 논문

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

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DOI:

10.3791/3830

⸱

2012년 1월 11일

 ,  , 
1Albrecht-Kossel-Institute for Neuroregeneration, University of Rostock

이 논문에서

요약

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

초록

성장, 증식 그리고 마지막의 연결을 차별화에 대한 3 차원 (3D) 공사장 공중 발판의 영향은 신경 장애 또는 neurodegenerative 질병에서 세포 기반 및 표준 치료에 대한 새로운 방법을 찾기 위해 큰 관심입니다. 3D 구조는 2D 문화보다 생체내 상황에 더 가까워지는 환경을 제공 것으로 예상된다. 재생 의료의 맥락에서 신경 줄기 및 전구 세포로 biomaterial의 공사장 공중 발판의 조합 치료 도구로 큰 약속을 보유하고 있습니다. 3 차원 환경을 에뮬레이션 1-5 문화 시스템과 줄기의 다양한 유형의 증식과 분화에 영향을 표시되었습니다 전구 세포. 여기에, 3D - microenviroment의 형성과 functionalisation가 포함된 세포의 생존과 운명을 결정하는 것이 중요합니다. 6-8 여기 PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), 펩타이드 기반 히드로겔 발판을 사용잘 설명하고 다른 세포 유형에 3D - 환경의 영향을 연구하는 데 사용되는. 7,11-14 PuraMatrix 쉽게 사용자 정의와 나노 섬유의 합성 제조 어느 높은 신뢰성의 3D 문화 시스템을 제공 수 또한 외부의 자유입니다.

최근 우리는 발판의 형성에 대한 PM - 농도의 영향을 연구했습니다. 본 연구에서는 13 PM의 사용 농도는 원자 힘 현미경에 의해 입증되었다 3D 구조의 형성에 직접적인 영향을 미쳤다. hNPCs의 생존과 분화의 후속 분석은 내장 세포의 운명에 대한 PM의 사용 농도의 영향을 밝혔다. 그러나, immunofluorescence 기법의 posses 어떤 장애물에 의해 생존의 연결이나 분화의 분석. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면 하나는 예의 상대 번호를 얻기 위해 매트릭스 내에서 세포의 총 수를 결정한다. βIII - tubulin에 의한 표시의 연결을 세포. 이 전제 조건이 표본의 Z - 스택을 취할 수 형광 현미경과 같은 공촛점 현미경 또는 유사한 기술의 모든 3 차원에있는 공사장 공중 발판을 분석하는 기술. 또한 이러한 종류의 분석은 매우 시간이 소요됩니다.

여기 유동세포계측법하여 나중에 분석 예에 대한 3D - 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 ReNcell VM 셀 라인의 인간 신경 전구 세포 (hNPCs) (Millipore 미국)가 교양되었으며 laminin (PML)과 보충 PuraMatrix (PM) 또는 PuraMatrix 구성 3D - 공사장 공중 발판으로 차별. 우리 손에 0.25 %의 PM - 농도 그러나 농도가 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다. 12이 출시 세포 유동세포계측법 예를 들면 immunocytochemical 연구에 사용되며 이후 분석할 수, 세포 13 재배를위한 최적했습니다. 분석 및 MO,이 속도데이터의 신뢰성을 향상보다 기본에, 얻은 데이터 휴식을 통해 다시.

프로토콜

1. 제 1 부 : PuraMatrix에 hNPCs의 문화

  1. laminin 무허가 0.25 %의 PuraMatrix 농도와 발판의 세대 사전에 다음과 같은 솔루션을 준비 필요
  2. 20 %의 자당 및 멸균 증류수에 용해 10 % 자당을 포함하는 솔루션을 포함하는 솔루션을 준비합니다.
  3. 1.5 ML 원뿔 튜브에 증류수 120 μl와 20 %의 자당 솔루션의 해결 방법 1 혼합 120 μl하십시오.
  4. 1.5 ML 원뿔 튜브에 20 % 자당 용액 60 μl로 PuraMatrix 솔루션의 솔루션이 혼합 60 μl하십시오.

다음과 같은 솔루션을 준비하는 laminin (100 μl 매트릭스 1 일 8 μg) 1을 필요로하는 보충 0.25 %의 PuraMatrix 농도와 발판의 준비.

  1. 20 % 자당 용액 120 μl와 1.5 ML 원뿔 튜브에 48 μl laminin과 증류수의 해결 방법 1 혼합 72 μl하십시오.
  2. 1.5 ML 원뿔 튜브의 20 % 자당 용액 60 μl와 혼합 용액이 60 μl PuraMatrix 솔루션.
  1. PuraMatrix에서 세포의 embedment은 4 - 음 세포​​ 배양 판을 준비 두 우물의 소독 유리 커버 슬립 (직경 13mm)을 장소. 나중에 사용하기 위해 클린 벤치에 금속판을 저장합니다. 유리 커버 풀렸는데은 immunocytochemical 연구에 사용됩니다. 더 immunocytochemical stainings이 의도되지 않으면 단계는 생략 수 있습니다.

3D 공사장 공중 발판의 하나의 캡슐에 대한 hNPCs를 준비하려면 다음과 같은 솔루션을 준비하고 있습니다. 희석 요소 1:10.000의를 사용하여 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 용액에 Benzonase을 희석. Trypsin-Inhibitor/Benzonase 솔루션 믹스의 경우 : DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + 트립신 억제제 - (0.5mg/ml).

  1. 인큐베이터에서 5 분 (37 ° C, 5 % CO 2) 500 μl 트립신 / Benzonase 솔루션과 부화를 추가하여 세포를 분리. Trypsin-Inhibitor/Benzonase 솔루션 반응을 중지합니다. 이후 3000 X G.에서 5 분 분리된 세포를 원심 분리기 5 ML 10 % 자당 솔루션 세포를 씻고 다시 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
  2. 10 % 자당 용액에 세포를 Resuspend, 최종 셀 솔루션은 1x10 6 셀 / ML을 포함해야합니다.

다음 단계는 1.8 1.11로이 때문에 세포에 대한 유해 수도 PuraMatrix 솔루션의 낮은 산도의 최대한 빨리 완료되어야합니다.

  1. 솔루션 1 세포 현탁액의 60 μl를 섞는다.
  2. , 해결 방법 1 120 μl를 추가 솔루션 2 원뿔 튜브로 세포를 포함하고 조심스럽게 섞는다.
  3. 각 커버에 즉시 혼합물의 장소 100 μl는 4 판에서 잘 살고 전표.
  4. 당 잘 후에 2~3분 다른 200 μl를 천천히 200 μl 세포 배양 매체를 추가합니다. 이것은 모체의 자기 조립을 시작합니다.
  5. 부화 C37 ells ° C, 열판 또는 클린 벤치의 가열 영역에 클린 벤치에서 1 시간을 위해. 이것은 매트릭스의 조립을 해칠 수도로 최대한 접시를 이동하지 않습니다.
  6. 매체의 대부분을 제거 전부는 아니지만, 매트릭스는 1000 μl 피펫으로 건조 떨어지는 피하기 위해. 10 분에 대한 매트릭스를 씻어 중간 500 μl를 추가합니다. 마지막으로 매체를 제거하고 500 μl 신선한 매체를 추가하고 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)의 문화 판을 놓습니다. 매트릭스는 접시가 별도의 보육에 가능하면 같은 덜 가능한 이동 및 보관해야합니다 충격에 민감하다으로.
  7. 여기에 사용된 hNPCs는 3D - 공사장 공중 발판을 7 일 동안 확산되었으며 차별화는 성장 요인 13 철수에 의해 시작되었다. 매체는 2-3일마다 변경되었습니다.

2. 2 부 : 전체 매트릭스의 Immunocytochemical 염색법

  1. 얼룩 절차 사전에 하나는 준비가 필요 : AB5% 정상 염소 혈청 그리고 Triton X - 100 PBS, 0.1 M PBS에 따라 4 % paraformaldehyde 용액에 용해하여 4 솔루션 ', 6 Diamidin - 2'- phenylindoldihydrochlorid를 필요한 경우 (의 0.3 %로 구성된 잠금 버퍼 솔루션 PBS에 녹아있는 100 NG DAPI / ML을 포함하는 핵의 얼룩에 대한 DAPI). 샘플은 Mowiol와 DABCO의 혼합물과 함께 장착했다.
  2. 매트릭스는 1000 μl 피펫으로 매체를 제거하고 5 분 번 PBS로 공사장 공중 발판을 씻어 씻어.
  3. 공사장 공중 발판이 PBS를 제거하고 각 잘하는 paraformaldehyde 400 μl (0.1 M PBS 4 %)를 추가하고 실온에서 30 분 매트릭스를 품어 수정합니다. 고정 공사장 공중 발판은 몇 개월에 몇 주간을위한 최대 0.02 % 4 난이 3 ° C와 보충 PBS에 저장할 수 있습니다.
  4. 얼룩에 앞서 5 분 PBS로 공사장 공중 발판을 씻으십시오.
  5. 버퍼 솔루션을 차단에 공사장 공중 발판을 품어. 차단 솔루션은 세 번 매 2-3시간 및 subsequ 변경되었습니다ently 공사장 공중 발판은 4 박 이상 차단 솔루션 incubated되었습니다 ° C.는
  6. 차단 버퍼 용액을 제거, 1 % 정상 염소 혈청과 보충 PBS에 녹아있는 주요 항체를 추가하고 4 박 이상의 매트릭스를 품어 ° C.
  7. 기본 항체 솔루션을 제거하고 세차 4 박 이상의 4 2 H에 대한 시간과 이후를 공사장 공중 발판 ° C를 PBS로.
  8. PBS를 제거하고 PBS에 녹아있는 보조 항체와 솔루션을 추가 어두운 실내 온도 4 H를 위해, 1 % 정상 염소 혈청과 보충.
  9. 4 박 이상의 1 H 및 이후 ° C 어둠에 대한 PBS 4-6 배로 샘플을 씻으십시오.
  10. 핵의 얼룩 한 30 분 DAPI 용액 400 μl를 추가할 수 있습니다.
  11. 하나는 현미경 슬라이드를 필요로하는 샘플을 마운트합니다. 현미경 슬라이드 50 μl Mowiol / Dabco을 추가합니다. 4 - 음 판의 커버 전표를 제거하고 장착 매체에 조심스럽게 올려.
  12. 여기 Biozero 8000를 사용하여현미경은 (Keyence, 독일, 카를 스루에) 하나의 micrographs 및 Z - 스택을 얻을 수 있습니다. 각각의 스택은 1-2 μm의의 거리 30 사진을 하나 들어 있습니다. 해당 분석기 소프트웨어를 사용하여 형광에 내재된 부분은 Z - 스택이 생성되었습니다의 전체 계획하기 전에 제거되었습니다.

3. 제 3 부 : 유동세포계측법 분석을위한 공사장 공중 발판에서 hNPCs 공개

  1. 공사장 공중 발판에서 세포의 출시로 사전에 500 μl HBSS와 공사장 공중 발판이 씻으십시오.
  2. 세포 배양 매체를 포함 15 ML 원뿔 튜브에 1000 μl 피펫에 의해 공사장 공중 발판을 전송합니다.
  3. 공사장 공중 발판을 방해하는 것은 기계적으로 1000 μl 피펫으로 세포 솔루션 여러 번 resuspend하고 이후 5 분 3,000 XG에서 솔루션을 원심.
  4. 피펫으로 뜨는 제거 트립신 / Benzonase 솔루션 500 μl를 추가하고 세포 펠렛 여러 번 resuspend.
  5. 5 분 전지를 품어37 ° 트립신 / Benzonase 솔루션 C. 반응 1 ML의 Trypsin-inhibitor/Benzonase 솔루션을 추가하고 여러 번 아래 피펫 및 중지합니다.
  6. 세포 현탁액에게 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 두 ML의 HBSS 버퍼로 세포를 씻어. 이 단계를 두 번 반복합니다. 이 절차는 매트릭스 파편을 제거합니다.
  7. 세포 현탁액 솔루션 트로프 집계를 제거하고 세포 배양 매체에있는 세포를 수집하기 위해 셀 스트레이너를 (구멍 크기가 70 μm의) 전달합니다. 얻은 세포는 다시 패치 클램프 또는 fluometric 측정과 같은 기능 연구를위한 표지 전표에 예 씨앗을하실 수 있습니다. 유동세포계측법에 대한 세포를 처리하기 위해 (4.1 참조) 즉시 세포를 수정.

4. 4 부 : 유동세포계측법에 의해 βIII - tubulin 양성 세포의 부량

  1. 상온에서 15 분 1% PFA와 단계 3.7에서 얻어진 출시 세포를 수정.
  2. 3000 XG와 remov에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기E 뜨는합니다. 필요한 경우, 전지가 ° C 나중에 분석을 위해 4 저장할 준비를하실 수 있습니다. 세척 버퍼 (PBS가 0.5 % BSA와 0.02 % 나 - azide와 보충)에 따라서 resuspend 세포.
  3. 유동세포계측법 준비를 진행, 350 XG 10 분 세포 현탁액을 원심 분리기 뜨는을 버리고 항체 용액 25 μl의 세포를 resuspend. 따라서 첫 번째 항체는 농도 1:100 예 βIII - tubulin에 사포닌 버퍼와 혼합됩니다. 사포닌 버퍼는 0.5 %의 사포닌 농도, 0.5 %의 BSA 농도와 0.02 %의 나 - azide 농도로 PBS로 구성되어 있습니다.
  4. 뿌리에서 상온에서 2 H에 대한 첫 번째 항체와 세포 현탁액을 품어. 대조군으로서 최초의 항체없이 샘플을 준비합니다.
  5. 첫 번째 세척 단계에 대한 세포로 직접 300 μl 사포닌 버퍼를 추가합니다. 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 두 번째 세척 단계, 폐기뜨는은 300 μl 버퍼를 추가하고 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기
  6. 뜨는을 제거하고 이차 항체 (예 : 알렉사 형석 647, 1:1000, 사포닌 버퍼에 용해)이있는 25 μl 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 보조 항체 1H와 세포를 품어.
  7. 첫 번째 세척 단계에 대한 세포로 직접 300 μl 사포닌 버퍼를 추가합니다. 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 두 번째 세척 단계 들어, 뜨는을 버리고 300 μl 버퍼를 추가하고 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기
  8. 뜨는을 취소하고 유동세포계측법 분석 500 μl 씻어 버퍼에있는 세포를 resuspend.

5. 대표 결과

자기 조립 히드로겔 발판 PuraMatrix에서 교양 hNPCs의 예제는 그림 1에 표시됩니다. hNPCs는 수정되지 않은 오후 구면과 같은 구조로 성장합니다. 이 문화 조건에서분야 간의 프로세스의 묶음은 (그림 1A) 볼 수 있지만 초, 세포는 거의, 전송 빛을 인식 수 없습니다. 사용 전지 종류의 문화 상황에 따라 매트릭스는 laminin를 추가하여 예 수정할 수 있습니다. hNPC 세포주에 대한 ReNcell VM (Millipore) laminin 적은 밀도 집계와 성장 패턴하지만 세포보다 균일한 분포 (그림의 1B)를 유도하기 위해 필요합니다. 수정의 독립, 매트릭스는 예 차별의 연결을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1C는 마커의 연결 βIII - tubulin에 대한 hNPCs의 얼룩을 선물한다. 이 예제에서는 세포가 모체에서 7 일 동안 재배되었으며 이후 분화가 성장 요인의 EGF와 bFGF 13. 셀 기관의 철회 및 세포 구축 프로세스의 고밀도 네트워크에 의해 유발되었다 4 일에 대한 차별화된 수 쉽게 인식. 그러나, 그것은 전화 번호의 부량가 많은 등, 시간이 소요됩니다 것을 분명모체의 다른 지역 사진은 통계 분석을 위해 신뢰할 수있는 데이터베이스를 얻을, 분석한다. 무화과 1D 하나의 매트릭스에서 출시하고 이후 표지 전표에 platted 세포의 예제를 볼 수 있습니다. 이러한 세포 기능 연구에 사용할 수 있습니다.

3D - 공사장 공중 발판에서 세포의 릴리스는 마커 단백질이나 AnnexinV / PI 염색법 또는 TUNEL 분석하여 세포의 생존율의 표현처럼 다른 매개 변수를 분석할 수있는 가능성을 제공합니다. 그림 2는 βIII - tubulin의 + 세포의 비율의 유동세포계측법 분석의 예를 보여줍니다. 부정적인 제어 (세포 βIII - tubulin에 대한 표시되지 않음) 그림 2A에 표시됩니다. 이러한 컨트롤은 βIII - tubulin + 세포의 이상 검출 (그림 2B)의 게이트를 결정하는 데 사용됩니다. 세포의 수동 계산 및 유동세포계측법하여 분석의 비교 그림 2C에 표시됩니다. βIII - tubulin의 + 세포의 비율은 determ되었습니다전체 휴대폰 번호 (핵 DAPI의 얼룩에 의해)과 형광 그림 βIII - tubulin +는 세포의 수를 세어 ined.

figure-protocol-1
그림 1. hNPCs은 자기 조립 펩티드 히드로겔 PuraMatrix에 교양. 분야의 직경이 수백 μm의 최대가 될 수있는 PuraMatrix에 캡슐) hNPCs은 (PM), 구면, 고밀도 포장 구조에서 성장. 분야 사이에 하나는 세포 (화살표)에 의해 구축 프로세스의 번들을 확인할 수 있습니다. B) PuraMatrix에서 캡슐 세포는 laminin이 (PML) 자세한 homogenously 분산, 적은 고밀도 구조의 성장과 함께 보충. 행렬 하나가 덜 밀도 지역 (화살표)에서 단일 세포를 인식할 수 보충 laminin에서, 그러나 그것은 세포의 숫자를 정할 거의 가능합니다. C) hNPCs는 βIII - tubulin (녹색)과 같은 PML의 연결을 표현 마커 4 일 동안 차별. evalua하기하나는 DAPI (파란색)과 같은 핵의 얼룩으로 전체 휴대폰 번호를 확인할 수있다 긍정적인 세포 테 비율입니다. microphotograph는 Biozero - 8000 현미경으로 찍은 사진의 Z - 스택의 전체 투영을 선물한다. D) 매트릭스에서 발표된 전지는 추가 기능 연구에 대한 예를 들어 표지 전표에 씨앗을하실 수 있습니다. microphotograph는 이후 릴리스 절차 3D에 대한 교양 세포를 보여줍니다. βIII - tubulin에 대한 얼룩 (적색)는 3D 발판에서 호스팅하는 셀에 비교 형태를 보여준다.

figure-protocol-2
그림 2. 유동세포계측법 분석 전지는 PuraMatrix에서 발표했다. 우리가 PuraMatrix가 유동세포계측법하여 빠르게 분석에 대한 액세스를 제공에서 교양 세포를 릴리스하는 프로토콜을 사용 microphotographs의 시간이 소요 부량을 극복하려면 다음과 같이하십시오. A) 흠없는 세포는 이후 분석을 위해 게이트 (블랙 프레임)을 설정하기 위해 대조군으로 사용되었다예 βIII - tubulin의 세포. B) 부정적인 컨트롤에 설정된 동일한 문가, 사용했습니다 βIII - tubulin + 세포의 비율을 계량합니다. 긍정적인 세포는 중간 인구가 관찰되었다 X - 축 (점선 프레임), 가능성이 높습 대표 세포 파편의 오른쪽 부분에 나타납니다. C) 유동세포계측법로 가늠 수동 계산 세포와 세포의 비교 βIII - tubulin의 숫자의 시간 의존성 + 유동세포계측법 프로토콜의 안정성을 나타내는 비교할되었다 긍정적인 세포의 훨씬 높은 비율을 공개했다.

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토론

3D - 공사장 공중 발판의 사용은 세포 배양 상황에 가까이 생체내 상황에서 다른 세포 유형의 개발을 연구하는 기회를 제공합니다. 그러나, 예를 들어의 연결을 차별하거나 한 세포 유형의 예 부량에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 몇 가지 장애물을 극복하기 위해이 기능 연구의 분석에 관한.

여기 발판 PuraMatrix 및 FACS 또는 기능 assays 같은 도구에 쉽게 액세스를 제공하는 2D 상황에서 연구에 사용되는 세포의 이후 릴리스를 기반으로 펩타이드 히드로겔에 hNPCs의 문화를 설명했다. 최근 우리는 원자 힘 현미경과 생존과 세포의 분화에 영향을하여 3 차원 비계의 형성에 PuraMatrix 농도의 영향을 보여주었다. 13 그러나 한 각 세포 유형의 서로 다른 문화를해야 할 수도 염두에두고있다 다른 물질로 구성된 조건이나 매트릭스는 matrig 예를 들어엘이나 콜라겐.

세포를 릴...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 자신의 우수한 기술 지원 노먼 크루거 감사하고 싶습니다.

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
PuraMatrix 펩타이드의 히드로겔 Bioscience BD 354,250
마우스 laminin I Cultrex 400-2009090
자당 시그마 S9378 - 1KG
정상 염소 혈청 Dako X0907
트리톤 X 100 로스 3051.3
PBS Dulbecco Biochrom AG L 1825
HBSS Gibco 14170-088 행크스 '균형 소금 솔루션 1X
βIII - tubulin 항체 산타 크루즈 SC - 51670 단클론 마우스, 1:500
알렉사 형석 488 Invitrogen 11,029 염소 α 마우스, 1:1000
알렉사 형석 568 Invitrogen 11,031 염소 α 마우스, 1:1000
알렉사 형석 647 Invitrogen 21,235 염소 α 마우스, 1:1000
Mowiol 4-88 시약 Calbiochem 475,904
Dabco 올드 리치 D2 ,780 - 2 1,4 - Diazabicyclo [2.2.2] 옥탄 98%
셀 스트레이너 BD Biosciences 352,350 70 μm의 기공 크기
사포닌 머크 7695
트립신/ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) GIBCO 25300-054
Benzonase 250 U / μl 머크 1.01654.0001
트립신 억제제 시그마 T6522 (500 MG)
20% HSA Octapharma 인간 알부민 Kabi 20%

참고문헌

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