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방법 논문

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

14.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3840

⸱

2012년 4월 1일

 ,  ,  , 
1Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 2University of Connecticut

이 논문에서

요약

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

초록

외부 자극에 대한 반응으로 세포 운동은 상처 치유, 염증 및 감염에 대한 응답을 포함하여 많은 세포 과정에 필수적입니다. chemotaxis를 측정하기위한 일반적인 방법은 세포 chemoattractant는 다공성 막에 의해 분리되는 Boyden 챔버 분석이다. 세포 chemoattractant 향해 막 통해 마이 그 레이션함으로써, 그들은 멤브레인, 또는 기본 미디어에 가을의 아래쪽을 준수하고, 이후 물들일 시각 1 포함됩니다. 이 방법에서는 세포 조직이 발견 그라디언트의 가난한 표현이 될 것으로 생각됩니다 가파른 및 과도 chemoattractant 그라데이션에 노출됩니다.

또 다른 분석 시스템, 세 이하 아가로 오스 chemotaxis 분석, 3, 아가로 오스 층 아래에 형성 얇게 수성 영화에서 고체 기판에 걸쳐 네 대책 전지 운동. 아가로 오스에서 개발하고 기울기는 얕은이며 애플 리케이션이 될 것으로 생각된다자연스럽게 그라디언트를 발생의 표현을 ropriate. Chemotaxis은 여행 거리 미세한 영상으로 평가할 수 있습니다. Boyden 챔버 분석과 세 이하 아가로 오스 분석 모두는 일반적으로 끝점 assays로 구성됩니다.

자동 ECIS / 택시 시스템은 전기 세포 기질 임피던스 감지 (ECIS) 5, 6 세 이하 아가로 오스의 접근 방식을 결합한 제품입니다. 본 분석에서는 대상 전극은 8 실 각에 위치해 있습니다. 대규모 반대 전극은 8 실 (그림 2) 각을 통해 실행됩니다. 각 챔버는 아가로 오스 가득한 두 개의 작은 우물이 대상 전극의 양쪽에있는 아가로 오스의 상처가있다. 다른 diffusing chemoattractant의 소스 (그림 3)을 보유하면서 하나가 아니라, 테스트 셀 인구들로 가득 차 있습니다. 시스템을 통해 전달되는 전류는 세포가 대상 전극을 통해 전달로 발생하는 저항의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 세포는 electrod전자 시스템 6 저항을 증가시킵니다. 또한, 저항의 급속한 변화는 전극 표면과 세포의 상호 작용의 변화를 나타내며 지속적인 세포의 형태 변화는 지표. ECIS / 택시 시스템은 장시간 동안 실시간으로 세포 인구의 움직임을 측정할뿐만 아니라 대상 전극에 단일 세포의 도래를 감지 정도를 구분하실 수 있습니다.

Dictyostelium discoidium는 엽산 그라디언트 7, 8 및 chemotactic 응답을 정확하게 ECIS / 택시 9 측정할 수의 면전에서 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다. 백혈구 chemotaxis은 SDF1α 및 chemotaxis의 antagonists에 대한 응답도 ECIS / 택시 10, 11로 측정되었습니다. SDF1α에 백혈구 응답의 ​​예제는 그림 1에 표시됩니다.

프로토콜

1. ECIS / 택시 전극 준비

  1. ECIS / 택시 전극 배열 (슬라이드 당 8 방으로 구성된)의 금색 표면이 먼저 무균 조건 하에서 실온에서 15 분 대한 탈이온수 (DH 2 O)의 멸균 10 밀리미터 시스테인과 사전 치료에 의해 ​​안정화된다.
  2. 각 전극 챔버에서 시스테인 솔루션을 대기음, 멸균 DH 2 O로 3 회 씻어, 그리고 완전한 매체 250 μl (RPMI 1640 10 % FBS, 25 밀리미터 HEPES 완충액)으로 바꿉니다.
  3. 전극 검사를 수행하기 위해 악기 배열 홀더의 핀에 연락을 전극 배열을 연결합니다.
  4. 제대로 연결되어 챔버 스가 컴퓨터 화면에 녹색으로 강조 표시됩니다. 챔버 스는 빨간색으로 강조되어있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극은 모든 챔버에 대한 연락처를 설정하는 배열의 홀더에 다시 배치해야합니다.
  5. 모든 챔버가 연결되면, 억제하기 위해 소프트웨어 컨트롤러에 '확인'버튼을 클릭각 챔버의 초기 저항 및 커패시턴스 값을 내꺼야. 저항 값은 1600 사이 및 2000 ohms 있어야하고, 커패시턴스 값은 8 챔버 어레이 5 사이와 6 nanofarads 있어​​야합니다. 실로이 허용치 안에 있지 않다면, 각각의 챔버는 데이터를 수집하는 데 사용해서는 안됩니다.
  6. 개별 아가로 오스의 챔버를 준비하는 배열 자의 전극 연결을 끊습니다. 챔버에서 미디어를 기음과 멸균 DH 2 O를 사용하여 각 챔버에게 3 회 ​​씻어

2. 아가로 오스 챔버 준비

  1. 멸균 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브에서 측정 0.03 Seakem GTG 아가로 오스의 G와 1 ML 멸균 PBS를 추가합니다. 느슨한 튜브 뚜껑을 교체하고, 2 분 액체주기 위해 압력솥에서 아가로 오스를 (전자 레인지에 녹는이 분석을 위해 효과적이지 않을 것입니다) 용융. 이 짧은 시간은 원뿔 튜브를 용융하지 않습니다. (예 : Dictyostelium의 discoideum) 0.5 %, 문화 혈청 필요하지 않습니다 덜 까다로운 세포에 대한아가로 오스는 적절한 매체를 만들어 전자 레인지에 녹인 수 있습니다. 전자 레인지에 녹인 경우가 변성되므로 압력솥은 혈청이 필요 세포가 필요합니다.
  2. 물 목욕으로 예열 완료 RPMI 매체의 5 ML 추가 (55 ° -60 ° C)에 직접적으로 뜨거운 아가로 오스로, 0.5 % 아가로 오스와 pipet 최대의 최종 농도로 아래로 부드럽게 섞는다하기.
  3. 각 챔버로 녹인 아가로 오스 매체 Pipet 300 μl는 ECIS / 택시 배열 덮개를 교체하고 실온에서 젤 수 있습니다.
  4. 아가로 오스의 겔화을 평가하기 위해 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스 남은 Pipet. 이 과잉 아가로 오스는 부분 4도 사용됩니다 : 아가로 오스로 우물을 절단.

3. 그럼 절삭 공구를 건설하고 정맥을 선명하게

  1. , 64분의 5 '비트. 느린 속도 훈련과 각 정맥 개구부의 드릴 비트의 팁을 회전을 사용하는 드릴 비트는 각 정맥 조합의 전체 내부 가장자리를 깎는 특정 만드는 두 개의 14 게이지 뭉툭한 끝 캐뉼러를 선명하게날카로운 커팅 에지 (그림 4A)를 형성 ening.
  2. 드릴 프레스의 비트 1 "X 2"X ¼ "64분의 5와 플렉시 글라스 (그림 4B-D) '을 통해 구멍을 드릴 다운합니다. 이는 각 플렉시 글라스 구멍을 통해 동등한 거리를 protrudes 있도록 각 둘레에 14 게이지 정맥을 삽입합니다.

4. 아가로 오스로 웰스를 절단

  1. 가볍게 팁을 불타는하여 14 게이지 캐뉼러를 소독. 이전 ECIS 챔버에 우물을 절단하기 캐뉼러는 실내 온도에 냉각 허용하거나, 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스를 만지고하여 캐뉼러 진정해. 정맥의 온도가 너무 높으면 챔버 우물이 절단되면서, 아가로 오스는 우물이 결함 및 결함 렌더링, 용융 것입니다.
  2. 각 챔버의 대상 전극 (그림 2C 및 5)을 둘러싼 두 골드 도트 위에 정맥 쌍을 맞춥니다. 정맥 사이의 부드러운 접촉시 중지, 모든 수평 움직임없이 정맥 세로를 삽입전극 표면. 조심스럽게 모든 수평 움직임없이 다시 정맥을 제거하십시오. 그라디언트에 반대에 대한 추가 우물의 위치는 정맥의 지그의 재구성과 함께도 가능합니다.
  3. 부드럽게 아가로 오스 폐기물을 잡으면 진공 트랩으로 낮은 진공 압력에 연결된 멸균 9 "파스퇴르 피펫을 사용하여, 정맥으로 남아 아가로 오스 플러그를 기음.
  4. 아가로 오스를 포화 위해 2 분 동안, 37 각 챔버의 표면 ° C로 완벽한 RPMI 미디어 300 μl를 추가한 다음 부드럽게 아가로 오스를 방해하지 않고 표면과 우물에서 미디어를 기음.

5. 웰스로드

  1. 각도 7 μl의 볼륨을 들고이 가능합니다. 각 침실에 잘하려면, 셀 서스펜션 7 μl를 추가합니다. Jurkat T 세포의 경우, 2 개의 x10 7 셀 / ML을 사용합니다. 이러한 세포는 200 혈청 부족 불완전 RPMI로 희석 NG / ML SDF-1α, 7 μl에 응답할 것입니다. 부정적인 cont로 혼자 완벽한 미디어를 사용rol.
  2. 우물이로드되고 나면, 모든 우물을 중단하고 적절하게 가득 차 있었다되도록 거꾸로 현미경과 함께 배열의 각 챔버를 볼 수 있습니다. 세포가 잘의 경계의 범위 내에서에 있어야합니다. 그들이 우물에 모두 볼 수있다, 또는 셀 아니라 테두리 넘어서 퍼져있다면 큰 차이가 아가로 오스 아래 형성 하였다. 데이터가 안정적으로 그 챔버에서 해석할 수 없으므로, 부적절하게 설정 우물을 적어 둡니다.

6. 데이터 수집

  1. 배열 홀더에 전극을 배치하고 소유자의 용수철 포고 핀에 전극 배열에 금색 패드를 다시 연결하고 "설정"을 클릭합니다. 제대로 연결되어있는 우물은 녹색으로 강조 표시됩니다. 우물 빨간색으로있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극이 배열 보유자로 재지정해야합니다.
  2. 배열 구성을 표시하는 소프트웨어 패널의 드롭 다운 메뉴에서 "8WE1"을 (8 아니라 한 전극)을 선택합니다.
  3. 소프트웨어 contr에서 "확인"을 선택각도에 대한 초기 저항 및 정전 용량 값을 결정하는 마셨다 패널. 커패시턴스 값이 5와 6 사이 nanofarads이어야하는 동안 저항 값은, 1600 사이 및 2000 ohms 있어야합니다.
  4. 여러 주파수에서 저항을 측정하는 여러 주파수를 선택합니다. 주파수를 사용자 정의하거나 권장 주파수의 집합을 사용하는 선택이있다. 표준 다중 주파수 인수 설정은 8 우물 / 분 속도로 11 미리 설정된 주파수 (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 및 64,000 Hz에서)에서 데이터를 캡처. 측정 사이의 시간 간격도 사용자 정의할 수 있습니다. 여러 주파수 데이터를 수집하는 것은 정전 용량, 임피던스, 그리고 저항의 분석을 허용합니다. 4,000 Hz에서에서 저항 값을 수집하는 것은 포유 동물 세포 chemotaxis 연구를 위해 일반적으로 충분하지만, 추가 주파수가 다른 문맥 12,13에 정보를 제공할 수 있습니다.
  5. 총 실험 기간은 오른손에 설정할 수 있습니다패널이나 실험은 세포가 전극에 도착 지표 저항을 제작하시면 "Finish"를 클릭하여 수동으로 중지 할 수 있습니다. 세포가 전극에 도달하는 데 걸린 시간은 사용된 전지 종류에 따라 다릅니다.
  6. 데이터 수집을 시작하려면 '시작'을 클릭하십시오.

7. 데이터 관리

  1. 데이터를 Excel로 내보낼 수 있지만, ECISθ 시스템을 함께 ECIS 1600R 소프트웨어는 ECIS / 택시 데이터를 분석하기위한 가장 효율적인 방법입니다.
  2. 소프트웨어 데이터 분석 도구 막대가 라디오 버튼 Z, R 및 C. 이들은 각각 임피던스, 저항 또는 커패시턴스는, X 축 (경과 시간)에 대한 수직 축에 꾸몄다 여부를 확인 포함되어 있습니다.
  3. ECIS / 택시 데이터를 가장 효율적으로 4,000 Hz에서에서 시간에 따른 저항으로 표시됩니다. 신속한 저항의 변동, 또는 microtransients (그림 1) 전극 위에 세포 운동의 증거입니다. O를 컴파일,R의 binning는 데이터 포인트가 있으므로 모든 포인트가 그래프로 나타납니다 것으로, ECIS / 택시 권장하지 않습니다 그것이 데이터의 평균 microtransients을 때문에.
  4. 그래프가 ECIS1600R 소프트웨어로 만든되면, 그것은 파일 메뉴에서 "수출 그래프"를 선택하고. TIF 또는. JPG 파일로 저장하여 내보낼 수 있습니다.

8. 대표 결과

셀룰러 chemotaxis은 4,000 Hz에서에서 저항의 증가로 표시됩니다. 대상 전극에 대한 세포의 도착도 OPP 동부 표준시에 설명된대로 microtransients, 또는 micromotion라는 저항의 급격한 변동의 모양으로 표시됩니다. 알., 2009 (그림 1) 14. 부정적인 결과는 일관된로 표시하거나, 그림 1에 빨간색으로 볼 수 4,000 Hz에서에서 저항이 약간 감소,있다. microtransients의 부재 또한 전극의 세포 운동의 부재의 표시이다. 저항의 증가는 직접적으로 프로입니다전극 10 건너 숫자 셀 portional. G 단백질 결합 수용체를 방해하는 것으로 알려져 단클론 항체의 추가는 chemoattractant에 대한 특정 또는 독소가 chemotaxis 11을 차단할 수 있습니다.

figure-protocol-1
1 그림. SDF1α. 인간의 Jurkat T 세포 (2.0x10 6 세포 / ml) 쇼핑에 대한 반응으로 인간의 Jurkat T 세포의 Chemotaxis은 SDF-1α의 구배에 노출되었다 부정적 컨트롤이나 RPMI 1640 (농도 펴기 100 NG / ML부터). 4,000 Hz에서에서 표준 저항 그래프되었다. 아무런 움직임은 RPMI 1640에 대한 노출로 본적이있는 동안 인간의 Jurkat T 세포는 같은 저항 및 microtransients의 증가에 의해 입증, SDF-1α에 대한 응답으로 옮겼습니다.

figure-protocol-2
그림 2. ECIS / 택시 위로보기 withou를 전극t 아가로 오스. 각 ECIS / 택시 전극은 8 각 방으로 구성되어 있습니다. 각 챔버 대형 전극 () 공유 및 개인 대상 전극 (B)가 포함되어 있습니다. 각 챔버는 또한 캐뉼러와 아가로 오스의 우물을 절단했을 때 가이드로 사용되는이 금색 동그라미를 (다)이 있습니다. 황금 사각형 (D)는 전극에 교류 전류를 적용하기 위해 포고 핀에 연결 접촉 패드입니다. 개별 대상 전극은 큰 카운터 전극 (E)와 각 회로에 있습니다.

figure-protocol-3
그림 3. 두 웰스는 각 아가로 오스-채워진 챔버로 침입한다. chemoattractant 잘 하나 추가하면 그것이 잘 chemoattractant에 가장 가까운 chemoattract 가장 높은 농도로, 아가로 오스의 그라디언트를 만들 diffuses. 세포 chemoattractant 높은 농도쪽으로 아가로 오스 아래 여행하고 대상 전극을 통해 전달할 수 있습니다. 으로세포가 대상 전극을 건너, 저항의 증가는 ECIS 1600R 소프트웨어에 의해 기록됩니다.

figure-protocol-4
4 그림. 플렉시 글라스 둘이 14 게이지 캐뉼러의 삽입. ) 64분의 5 "드릴 비트가 정맥 팁을 선명하게하는 데 사용됩니다. B) 두 개의 구멍이 배치 장면에 따라 14 게이지 캐뉼러을 수용하기 위해 플렉시 글라스로 뚫고는되어야한다. C)에 구멍을 보장하기 위해 드릴 프레스를 사용하여 수직 위치 pleixglass 표면. D)에 두 날카롭게 캐뉼러는 ¼ "플렉시 글라스, 간격 2mm (안쪽 가장자리에서 측정)를 통해 삽입됩니다. 이 날카롭게 캐뉼러 신중 우물를 잘라 아가로 오스에 삽입됩니다.

figure-protocol-5
그림 5. ECIS / 택시 챔버의 황금 점 캐뉼러를 정렬. 우물을 잘라내려면 날카롭게 캐뉼러가 있어야합니다ECIS / 택시 챔버의 바닥에 대상 전극 측면을 노릴 골드 도트로 정렬됩니다. 캐뉼러은 어떤 수평 움직임없이 수직으로 삽입하고, 같은 방식으로 제거해야합니다.

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토론

ECIS / 택시 분석의 소설 특성은 세포의 chemoattractant에 반응으로 실시간 데이터 수집을 자동화하는 기능을 포함합니다. 이 기술의 가장 일반적인 응용 프로그램이 개별 chemotactic의 그라디언트로 세포 반응을 측정하거나, chemotaxis의 agonists 및 antagonists의 혼합물로 구성되어 그라디언트로하는 반면, ECIS / 택시 접근도에서도 상당히 도움이 될 수있는 이러한 구성으로 유사 의무가있다 세포 반응 평가. 중복 또는 연속 그라디언트 것은 소설적인 방법으로 세포의 행동에 영향을 미칠 수있다는 좋은 증거가있다. 또한, 그것이 더 복잡한 그라디언트가 원위치 12, 13의 규범이다 가능성이 높습니다.

ECIS / 택시 분석은 다른 기술로 수없는 방법으로 이러한 다양한 그라디언트 구성의 모델링을 활성화할 수 있습니다. 예를 들어, 추가로 웰스를 추가하여, 한 g의 방향을 배포할 수 있습니다...

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공개 사항

데이비드 Knecht와 마이클 Lynes은 응용 생물 물리학, 주식 회사로 코네티컷의 대학에 의해 라이센스가되어 ECIS / 택시 기술에 대한 발행된 특허를 가지고

감사의 글

이 작품은 국립 보건원 (ES07408 및 EB00208)에서 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
ECIS Zθ 응용 생물 물리학 http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php
ECIS 전극 배열 응용 생물 물리학 8W Chemotaxis http://www.biophysics.com/cultureware.php
Seakem GTG 아가로 오스 BioWhittaker 분자 응용 50,070
RPMI1640 Cellgro 10-040
HyClone 태아 소 혈청 써모 과학 SH300703
PEnicillin / 스트렙토 마이신 MP의 Biomedicals 1,670,049 페니실린 5,000 IU / ML, 스트렙토 마이신 5 밀리그램 / ML
HEPES 버퍼 MP의 Biomedicals 1,688,449 1M 용액, 세포 배양 등급
14 게이지 스테인레스 스틸 정맥 (2) 4 인치 일반 실험실 공급 5-8365-1 무딘 지점

참고문헌

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  16. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).

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