방법 논문

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

DOI:

10.3791/3850

⸱

2012년 4월 24일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Physiology & Neuroscience, University of South Carolina, School of Medicine

이 논문에서

요약

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G 단백질 문이 안쪽 정류기 K와 상호 작용하는 약물을 식별을위한 실시간 검사 절차 + (GIRK) 채널이 설명되어 있습니다. 검정은 GIRK 채널 활동을 측정하는 막 잠재력에 민감한 형광 염료를 활용합니다. 이 기술은 세포 라인의 숫자에 사용하기위한 적응이다.

초록

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G 단백질 문이 안쪽 정류기 K + (GIRK) 채널은 호르몬과 신경 전달 물질의 광범위한 셀룰러 중재자 역할과 뇌, 심장, 골격근 및 내분비 조직 1,2로 표현됩니다. GIRK 채널들은 플라즈마 멤브레인 바인딩된, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)에 (신경 전달 물질, 호르몬, 약물 등) 리간드의 바인딩에 따라 활성화된다. 이 바인딩은 이후에 바인딩하고 GIRK 채널을 활성화 G 단백질 (G i와 G O)의 자극을 초래합니다. 일단 GIRK 채널은 K의 움직임 +에서 더 많은 부정이 될 가능성이 휴식 멤브레인를 일으키는 세포의 수 있습니다 열었습니다. 결과적으로 뉴런에 GIRK 채널 인증은 자발적인 행동 잠재력의 형성을 감소하고 흥분성의 신경 전달 물질의 석방을 억제. 마음에 GIRK 채널의 활성화함으로써 심장 박동을 둔화 맥박 조정기의 활동을 억제. 3에 대한 새로운 치료 대리인의 개발을위한 소설 대상을 나타냅니다. 그러나 이러한 채널 약리학이 크게 미개척 남아 있습니다. 안티 arrhythmic 대리인, 치료약의 약물과 항우울제를 포함한 약물의 숫자 GIRK 채널을 차단 있지만, 이러한 억제는 선택 아니므로 상대적으로 높은 약물 농도 3 시에 발생합니다.

여기서는 GIRK 채널의 새로운 변조기를 식별을위한 실시간 검사 분석을 설명합니다. 본 분석에서는 GIRK 채널을 표현의 연결을 AtT20 세포는 같은 비스 - (1,3-dibutylbarbituric 산)와 같은 멤브레인 가능성에 민감한 형광 염료와 함께로드됩니다 trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] 또는 HLB 021-152 (그림 1 ). 염료 분자 세포 (그림 1)에 강력하게 형광등 아래의 이해가된다. 치료GPCR의 리간드와 세포 열 GIRK 채널 자극. 세포의 결과 K + 유출 아웃 더 음수가 될 수있는 멤브레인 잠재력과 감소하는 형광 신호 (그림 1)을 일으 킵니다. 따라서 GIRK 채널을 통해 K + 유출을 조절 약물은 형광 플레이트 리더를 사용 assayed 수 있습니다. 다른 이온 채널 심사 assays 같은 원자 흡수 분광법 4 radiotracer 분석 5와는 달리, GIRK 채널 형광 분석은 빠른 실시간 저렴 심사 절차를 제공합니다.

프로토콜

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1. 세포의 준비

  1. 5% CO 2의 humidified 분위기에서 10 %의 목마 혈청 및 37 ° C에서 문화를 유지와 보완 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)에서 뇌하수체 AtT20 세포를 성장.
  2. 표준 trypsinization 절차를 사용하여 세포에게 5-7일마다 subculturing하여 문화를 유지합니다.
  3. 검정, 투명 하단의 문장은 우물, 폴리-L-라이신의 50 μL와 96 - 웰 플레이트. 우물은 인큐베이터에서 30 분 동안 건조하도록 허용합니다.
  4. 물론 당 30,000의 세포 밀도에서와 3-4일 동안 배양기에 세포를 저장하는 200 μL 미디어를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포를.
  5. 천천히 세포 단일층에서 문화 매체를 기음 한 끝에 진공에 연결된 마개 4리터 항아리와 다른 끝에 200 μL 피펫 팁으로 구성된 열망 설정을 사용합니다.
  6. 정상적인 완충 용액 200 μL (132 MM NaCl, 5 KCl MM, 1m로 세포를 씻어M CaCl 2, 1 밀리미터 MgCl 2, 5 밀리미터 덱스 트로 오스, 5 밀리미터 HEPES, NaOH로 pH를 7.4).
  7. 각도에 막 잠재적인 감....

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토론

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막 잠재력에 민감한 형광 염료가 이온 채널 조절 약물 9,10을 식별하는 데 사용되었습니다 있지만, 이것의 연결을 GIRK 채널 약물 발견에 대한 자신의 응용 프로그램의 첫 번째 보고서이다. 여기서 제시 GIRK 채널 형광 분석은 리간드 게이트 K + 채널의 심사를위한 빠르고, 신뢰할 수있는 실시간 방식을 제공합니다. 검정은 외인성 재조합 GIRK 채널 11 clonal 셀 라인 (AtT20, PC-12) 내생 채널을 표현하는 표현을 영원히 기억 세포 라인 (HEK293, CHO 등)을 포함한 세포의 광범위한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한, 분석 결과는 배아 줄기 세포 및 기본 세포 배양의 심사 의약품에 대한 적응 수 있습니다. AtT20 세포와 함께 사용로서 분석도 GIRK 채널에 여러 GPCR의 리간드 (somatostatin 및 carbachol)의 연구를 허용하는 추가 혜택을 제공합니다. 어떤 형광 분석과 마찬가지로 제어 실험은 전자로 수행되어야합니다.......

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공개 사항

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 미국 공중 보건 서비스 상을 NS-071530에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
DMEM CellGro 10-013
말 혈청 Invitrogen 16050-114
96 - 웰 플레이트 코닝 3603
폴리-L-라이신 시그마 - 올드 리치 P4707
Somatostatin 시그마 - 올드 리치 S9129
Carbachol 시그마 - 올드 리치 C4382
HLB 021-152 AnaSpec 89,300
Versette 자동 액체 처리기 ThermoFisher 650-01
Synergy2 형광 플레이트 리더 Biotek
Gen5 분석의oftware Biotek

표 1. 특정 시약 및 장비의 표.

참고문헌

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  1. Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
  2. Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly recti....

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태그

Synergy TwoAtT20GPCRZ

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