후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
동물은 비강에있는 chemosensory 시스템을 통해 주위의 향기가있는 환경을 드셔보세요. Chemosensory 신호는 식품 선택, 육식 동물, conspecific 및 동료 인식과 다른 사회적 관련 신호로 복잡한 동작에 영향을 미칩니다. 후각 수용체 뉴런은 (ORNs) 후각 상피에 포함 된 비강의 등 부분에 위치하고 있습니다. 이러한 양극성 뉴런은 (그림을 참조하십시오. 1, 원래 일반 생리학의 저널에 출판 Reisert & 조 1) 후각 망울에 축삭을 보내 후각을 커버 점액에있는 솜털의 방출에서 상피 국경에 하나의 dendrite를 확장 상피. 채널 (그림 1) - 속눈썹은 궁극적으로 ciliary 전달 채널, 순환 염기 - 게이트 (CNG) 채널 및 칼슘 2 + - 활성화의 망할 CIA를 통해 현재의 유입을 흥분성의로 연결 신호 전달 기기가 포함되어 있습니다. 다음의 depolarization는 전지 본체 2-4에서 행동 가능성 생성을 트리거합니다.
이 비디오에서 우리는 ORNs에서 odorant 유발 반응을 기록 할 수있는 '흡입 피펫 기술 "의 사용을 설명합니다. 이 방법은 원래로드 photoreceptors 5에서 기록하기 위해 개발되었으며,이 방법의 변형은 마우스 콘 photoreceptors 6 일부터 기록하도록 수정 jove.com에서 찾을 수 있습니다. 흡입 피펫 기술은 나중에도 ORNs 7,8에서 기록하도록 구성되었습니다. 간단히, 후각 상피 및 세포 분리의 분리에 따라, ORN의 전체 전지 본체는 기록 피펫의 끝으로 빨려 있습니다. dendrite과 속눈썹은 목욕 솔루션에 노출 예를 들어 odorant 또는 약리 차단 응용 프로그램을 활성화하는 솔루션 변경에 따라서 액세스 할 수 남아 있습니다. 이 구성에서, 세포 내 환경에 더 접근 얻은 없습니다 (NO 전체 셀 전압 클램프)와 세포 내 전압이 다를 무료로 남아있다. 이 모든속눈썹과 전지 본체 9 발사 빠른 작업 잠재력에 유래 속도가 느린 수용체 전류의 동시 녹음을 ows. 이 두 신호 사이의 속도론의 차이는 그들에게 서로 다른 필터 설정을 사용하여 분리 할 수 있습니다. 이 기술은 모든 야생 유형 또는 녹아웃 마우스에서 사용할 수 있습니다 또는도 ORNs의 특정 하위 집합에 라벨을 GFP를 표현 ORNs에서 선택적으로 기록하기 위해, 예를 들어 주어진 odorant 수용체 또는 이온 채널을 표현.
프로토콜
1. 녹음 설정
녹음 챔버는 공기 테이블에 장착되어 전기적으로 패러데이 케이지를 사용하여 차폐되어 위상 대비 광학있는 니콘 TE2000U 이클립스 (Eclipse) 역 현미경에 장착되어 있습니다. 플렉시 글라스 기록 챔버는 두 부분 부분적으로 장벽에 의해 분리되어 silanized 유리 슬라이드에 접착으로 구성되어 있습니다. 챔버의 한 부분이 다른이 odorant에 조기 정착의 노출하지만, 아직 사용하지 않은 셀을 최소화하기 위해 녹화 중에 자극 - 노출에 사용되는 동안 세포를 해결하는 데 사용됩니다. 녹음 설정은 pelleted 피펫 홀더 및 접지 전극에 장착 흡입 피펫 (아래 참조)으로 구성되어 있습니다. 흡입 피펫은 micromanipulator를 사용하여 위치하고 있습니다. 자극 솔루션은 각각의 사각형 튜브가 0.7 mm X 0.7 mm거든요, 트리플 통 유리 사각형 튜브를 사용하여 적용됩니다. 트리플 배럴 유리는 머니퓰레이터에 장착 동력 빠른 단계 재관류 시스템 (Sut에 연결되었습니다적이 SF-77B, 워너 계측기)과 ~ 45 °의 각도로 녹화 챔버를 입력했습니다. 트리플 통 유리의 끝은 트리플 통 유리의 마지막 얼굴 (개방)은 피펫의 가까이에 위치하도록 허용하고, 수직이라고 같은 다시 45 °의 각도로 beveled되었습니다. <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
흡입 피펫 기술은 동시에 ORN에서 냄새 유발 느린 수용체 전류와 빠른 biphasic 작업 잠재력을 기록하는 데 사용됩니다 electrophysiological 방법입니다. 세포의 플라즈마 막이 위반되지 않기 때문에,이 방법은 odorant 응답은 세포 내 요소의 세포질 이온 농도 또는 희석의 변화로 인해 변경되지 않도록 보장 방해받지 세포 환경을 남긴다. 셀은 긴 기간 (마우스 개구리 1 H에서 최대 4 H)에에서 기록 할 수 있습니다. 전지 본체는 기록 피펫 내부이기 때문에이 기술의 또 다른 장점은 자극이 ORN의 꼭대기 부분에만 전달되어,이 즉, 속눈썹 및 수지상 손잡이 (같은 경우가 생체 내) 따라서 전체 셀이 노출 된 경우 발생할 수있는 비 특정 효과를 제거. 셀이 비교적 잘 피펫, 높은 솔루션 유량의 끝에서 안정적으로 앉아에 의해 보호되며, 따라서 빠른 솔루션 변경 달성 될 수 있으므로 또한, 고 유량 쉽게 실의 손실이 발생할 수있는 긴밀한-인감 기록 구성에 비해 . 세포 액세스 권.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 수 없어요.
감사의 글
이 작품은 NIH DC009613, 인간 프론티어 과학 프로그램과 몰리 케어 휄로 십 (JR까지)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 물질의 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 / 모델 번호 | 코멘트 |
| 에어 테이블 | 장비 | 뉴 포트 (Newport) | ||
| 에어 펌프 | 장비 | 뉴 포트 (Newport) | ACGP | |
| 피펫 풀러 | 장비 | 셔터 | P-97 | |
| 붕규산 유리 | 장비 | WPI | 1B150-4 | |
| 니콘 이클립스 역 현미경 | 장비 | 니콘 | TE2000U | HG 램프, GFP 필터 및 목표 20X 및 최소 5 배를 갖춘 |
| 앰프 PC-501A | 장비 | 워너 | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| 다이아몬드 나이프 | 장비 | 맞춤 양복 | ||
| 디지타이저 Mikro1401 A / D | 장비 | 캠브리지 전자 디자인 | ||
| 필터 유닛 3382 | 장비 | Krohn Hite 법인 | ||
| 신호 | 소프트웨어 | 캠브리지 전자 디자인 | ||
| 자세 / AgCl 펠릿 성형 | 장비 | WPI | 64-1297 | |
| 피펫 홀더 | 장비 | 워너 | 64-0997 | 맞춤에 맞게 수정 headstage |
| 녹음 챔버 | 장비 | 맞춤 양복 | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | 장비 | 셔터 악기 | Micromanipulator MP85-1028 | |
| 미네랄 오일 | 용액 | 시그마 | 330779-1L | |
| 오실로스코프 TDS 1001 | 장비 | 텍트로닉스 | ||
| 세 질주 평방 유리관 | 장비 | 워너 | 64-0119 | 5cm 길이 0.6 mm의 ID, |
| 판막 | 장비 | 리 회사 | ||
| Valvelink 8.2 | 장비 | 과학 자동화 | ||
| SF-77B 재관류 빠른 단계 | 장비 | 워너 |
참고문헌
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
