방법 논문

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

DOI:

10.3791/3906

⸱

2012년 6월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

초록

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지난 10 년 동안 줄기 세포 이식은 잠복기 및 임상 연구에서 두 질환의 다양한 주 또는 보조 치료 양상 등의 증가하고 관심을 받고있다. 그러나, 기능적 결과 및 / 또는 조직 재생 다음과 줄기 세포 이식에 관한 결과가 매우 다양 날짜입니다. 일반적으로 임상 혜택은 기본 메커니즘 (들) 1의 깊은 이해없이도 관찰된다. 따라서 여러 노력은 정확하게 생존, 운명 및 이식할 줄기 세포 및 / 또는 그들의 마이크로 환경의 생리를 평가하는 데 궁극적인 목표로 이식 줄기 세포를 모니터링하는 다른 분자 이미징 modalities의 발전에 주도했습니다. 분자 이미징에 의해 결정 하나 이상의 매개 변수에서 관찰 변경 관찰된 임상 효과에 관한 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리의 연구는 bioluminescence 이미징의 통합 이용 (BLI), 자기 공명 영상 (MRI) 및 histological analysi에 초점S는 이식 줄기 세포를 평가합니다.

BLI는 일반적으로 비 invasively 세포 루시페라제-리포터 유전자를 표현하는 생화 학적 반응을 바탕으로 이식 2-7, 다음 셀 추적을 수행하고 시간에 세포 생존을 모니터링하는 데 사용되는 것은 그것의 기판에 빛을 다음과 같은 상호 작용을 방출 수 있습니다 (예 : D- luciferin) 8, 9. 반면 MRI는 민감도가 높은 MRI 대비 에이전트와 함께 세포 라벨 이후에 생성되는 반면에 달려 있지만, 10 임상 적용하고 정확하게 매우 높은 해상도를 11-15로 세포 이식을 찾습니다하는 데 사용할 수있는 비침습 기술이다 . 마지막으로, 사후 histological 분석은 높은 해상도와 감도있는 비침습 방법으로 얻은 연구 결과를 확인하기 위해 선택한 방법입니다. 또한 엔드 포인트 histological 분석은 우리가 이식할 세포 및 / 또는 주변 조직, 바의 상세한 phenotypic 분석을 수행할 수 있습니다형광 기자 단백질 및 / 또는 특정 항체와 직접 셀 라벨링의 사용에 SED.

요약하면, 우리는 여기에 시각적으로 서로 다른 줄기 세포 및 / 또는 환경 관련 생쥐의 CNS에서 이식 줄기 세포에 따라 특성을 해명하는 BLI, MRI 및 조직학의 complementarities를 보여줍니다. 예를 들어, 뼈가 골수는-파생된 유전자 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 반딧불 루시페라제 (fLuc) 및 청색 형광 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (MPIOs)로 레이블을 표현할 수 있도록 설계 stromal 세포를,에 이식할 예정 면역 - 관할 마우스 및 결과의 CNS는 BLI, MRI 및 조직학 (그림 1)에 의해 모니터링됩니다.

프로토콜

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1. 셀 준비

  1. 실험은 유전자 루시페라제 및 eGFP 기자 단백질을 표현하는 설계 전직 생체내 교양 줄기 세포 인구를 사용하여 시작되어야합니다. 여기는 이전 Bergwerf 외. 2, 5에 기술된 / 루시페라제 eGFP - 표현 murine 골수 파생 stromal 세포 (BMSC-Luc/eGFP)을 사용합니다.
  2. 1 μg / ML의 Puromycine로 보충 15 ML 전체 확장 매체 (CEM)에 T75 문화 플라스크 당 8 × 10 5 세포의 밀도의 전지 라벨, 플레이트 BMSC-Luc/eGFP 세포 이틀전 일.
  3. 세포가 37에서 48 시간 동안 성장할 수 있도록 허용 ° C에서 5 % CO 2.
  4. 5 추가 X 10 6 빙하 블루 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (GB MPIO) 성장 세포 배양에 당 ML 배지 (총 : 75 × 10 T75 문화 플라스크에서 15 ML 문화 매체 당 6 입자).
  5. endocytosis를 통해 입자 이해 가능하도록 16 시간 동안 알을 품다.
  6. 남은 입자를 멀리 씻으그리고 세포에 GB MPIO의 세포 confluency 및 균질 분포를 얻기 위해 추가로 24 시간 동안 성장할 수 있습니다.
  7. eGFP + 세포의 총 금액 eGFP + 및 GB MPIO + 세포의 비율을 계산하여 형광 현미경을 사용하여 시각적으로 입자 이해를 확인합니다.
  8. 워시 기가바이트 MPIO-라벨 BMSC-Luc/eGFP 전지 두번 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료 (5 분 T75 문화 플라스크 당 5 ML)에 따라 10 ML PBS 및 수확 세포와.
  9. 133 X 10 6 세포 / PBS에서 ML의 최종 농도에서 수확한 세포 resuspend 씻으십시오.
  10. 이식까지 얼음 세포를 유지.

2. 마우스의 CNS의 세포 주입

  1. 300ml의 intraperitoneal 주사 (80 밀리그램 / ㎏) + xylazine (16 밀리그램 / ㎏) 혼합하여 쥐를 마취시키다.
  2. 쥐가 잠들 수 있도록 5 분 동안 기다리십시오.
  3. 멸균 조작을 할 수 있도록 마우스 머리를 면도.
  4. stereotactic 프레임에 마우스를 놓습니다.
  5. 를 Desinfect피부와 생쥐의 눈이 탈수를 방지하기 젖었어.
  6. 두개골을 노출하는 중간선 두피 절개를 만들고, 주어진 좌표에 치과 드릴 버를 사용하여 두개골에 구멍을 뚫을 : 후부 2mm와 Bregma 옆으로 2mm합니다.
  7. 간단히 와동 세포 현탁액을하고 주사기의 세포 현탁액을 기음.
  8. 경질 아래에 2.5 mm의 깊이에서 주사기 바늘을 넣고 1 분 압력 평형을 허용합니다.
  9. 자동화된 마이크로 주입 펌프를 사용하여 경질하에 2mm의 깊이에서와 0.70 μl / 분 속도로 3 μl 세포 현탁액 (4 × 10 5 세포)를 주사.
  10. 주입된 세포 현탁액의 역류를 방지하기 위해 추가로 5 분 기다리십시오.
  11. 천천히 바늘을 철회하고 피부를 suturing 전에 피부 테두리를 소독.
  12. 탈수를 방지하기 위해 subcutaneously 300 μl 0.9 % NaCl 용액을 주사하고, 마취로부터 회복하기 위해 히팅 램프 아래에 마우스를 놓습니다. P를 관리제도적 기준에 따라 OST-요원은 진통.

3. 생체내 Bioluminescence에서

  1. isoflurane과 산소 3%의 혼합물에 의해 생쥐를 마취시키다.
  2. 광자 영상기에서 쥐를 넣은 isoflurane과 산소 1.5 %로 마취 수준을 줄일 수 있습니다.
  3. 정맥 kg의 체중 당 150 MG D-luciferin을 주사.
  4. 사진 비전 소프트웨어를 사용하여 5 분 영상을 취득.
  5. M3vision 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행합니다. 관심 고정 영역을 사용하여 관찰된 신호를 계량.

4. 생체내 자기 공명 영상에서

  1. N 2 O (3시 7분) : O 2 혼합물의 isoflurane 3퍼센트로 쥐를 마취시키다.
  2. 수평 9.4T MR 시스템의 restrainer에 생쥐를 삽입하고 마취 수준 O 2 혼합물의 isoflurane 1 % 감소 : N 2 O (3시 7분을).
  3. dehydra을 방지하기 위해 생쥐의 눈을 물에 적셔기는 마우스 배꼽 아래에 센서를 배치하여 체온을 모니터하고 호흡 속도를 모니터링하는 직장​​ 프로브를 연결합니다.
  4. 110 ± 분당 10 심호흡으로 호흡 율을 유지하고 ± 0.5가 ° C. 37 좁은 범위 내에서 체온이 일정하게 유지
  5. 마우스 머리와 자석의 중간 위치에 마우스를 위에 표면의 RF 코​​일을 배치합니다.
  6. 70 μm의 2 인 - 비행기 해상도로 줄기 세포 이주를 공부하기 위해 구체적인 해부 학적 정보 및 T2 *-가중 기울기 에코 (GE) 이미지를 취득하는 10 코로나 T2-가중 스핀 에코 (SE) 이미지 세트를 취득. 반복 시간 (TR)를 : 다음과 같이 순서대로 매개 변수를 설정 500 MS, 에코 시간 (TE) : 8 MS (GE 순서) 및 반복 시간 (TR) : 4,200 MS, 에코 시간 (TE) : 12.16 MS (SE 순서); 18x18 mm 2, 매트릭스 : 256x256, 1 밀리미터 슬라이스 두께 1mm 슬라이스 분리 (Paravision 5.1 소프트웨어) 뷰 (FOV)의 필드.
  7. 데이터 처리를 수행Amira 4.0 소프트웨어를 사용합니다.

5. 해부 조직학

  1. isofluorane (4 %), 산소 (0.5 L / 분)과 질소 (1 L / 분) 2 분 동안 혼합물을 흡입하여 매우 깊이 쥐를 마취시키다. 경추 탈구로 쥐를 희생.
  2. 두개골에서 마우스 두뇌를 제거하고 2 시간 PBS에서 4 % paraformaldehyde에서 뇌 조직을 흥분시키는.
  3. PBS의 20 % 자당의 하룻밤 PBS에서 10 %의 자당에 PBS, 2 시간의 5 % 자당에 2 시간 : 자당의 다양한 그라디언트 년 이후 두뇌를 배치하여 뇌 조직을 탈수.
  4. 액체 질소를 사용하여 뇌 조직을 고정시키고 sectioning 때까지 -80 ° C에서 조직을 저장합니다.
  5. 그라 이오 스탯을 사용하여 10 μm의 두께는 섹션의 섹션 뇌 조직.
  6. 화면에 GB MPIO 입자와 형광 현미경을 사용하여 eGFP 표현 세포에서 녹색 형광의 청색 형광을 위해 cryosections를 흠없는.
  7. 화면에 대한 cryosections를 흠없는염증성 세포에서 적색 / 녹색 배경 형광.
  8. 세포 이식은 상호 작용 내생 세포 인구를 (예 : microglia, astrocytes, T 세포, ...)를 식별하는 데 더욱 immunohistochemical 및 immunofluorescent stainings를 수행합니다.

6. 대표 결과

우리는 여기서 시각 생쥐의 CNS에서 루시페라제 / eGFP-표현 (줄기) 세포 집단의 성공 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 표현했습니다. 처음에는 쉽게 확인할 수 있습니다 BMSC-Luc/eGFP 세포의 효율 라벨에 설명된 기가바이트 MPIO의 라벨링 절차 결과는 형광 현미경 (그림 2A)를 사용. 다음으로, 기가바이트 엠피오의 접목에 따라 생쥐의 CNS에서 BMSC-Luc/eGFP이라는, 세포 이식의 생존은 루시페라제 활동 (그림 2B)을 기반으로 생체내 BLI에 의해 모니터할 수 있습니다. 또한, 이식할 세포의 정확한 지방화는 생체내에 의해 모니터할 수 있습니다 (그림 2C)의 철분 함유량을 기준으로 MRI. 마지막으로, histological 분석 BLI와 MRI로 확인한 결과의 검증을 허용합니다. 안정적인 생존은 시간에 안정 eGFP 표현 (그림 2D)에 의해 확인되었다. 본 내용의 colocalization eGFP은 - 표현 청색 형광 엠피오와 세포 것은 현지화 및 이식할 세포의 생존의 정확한 결정을 허용합니다. 또한, 줄기 세포의 이중 형광 라벨은 염증 세포가 5로 만든 배경 형광을 기반으로 거짓 긍정적인 결과를 관찰할 수있는 가능성을 줄여줍니다.

figure-protocol-1
그림 1. 처리 순서의 개요

  1. 휴대폰 라벨 : BMSC-Luc/eGFP은 ML 문화 매체 당 5 × 10 6기가바이트 MPIO 입자로 분류된다. 16 부화의 시간과 24 시간의 다음과 같은 휴식 기간이 지난 후에 세포를 위해 수확하고했습니다만 주입.
  2. 세포 이식 : bregma -2 음, 경질 미만의 중간선과 2mm에서 2 밀리미터 오른쪽 : 기가바이트 엠피오는 BMSC-Luc/eGFP는 다음과 같은 좌표에서 마우스의 뇌에 이식할 있습니다 분류.
  3. 생체내 BLI 년 : 체중을 D-luciferin/kg 150 밀리그램의 아래에 정맥 주사 관리, 생성된 빛이 광자 영상기를 사용 오분 동안 획득한 것입니다.
  4. 생체내 MRI 년 : 70 μm의 2 인 - 비행기 해상도를 갖춘 10 개 코로나 T2-가중 스핀 에코 (SE) 영상과 T2 *-가중 기울기 에코 (GE)의 이미지 집합 인수되었다. 반복 시간 (TR)를 : 다음과 같이 시퀀스 매개 변수가 있었 500 MS, 에코 시간 (TE) : 8 MS (GE 순서) 및 반복 시간 (TR) : 4,200 MS, 에코 시간 (TE) : 12.16 MS (SE 순서); 18x18 mm 2, 매트릭스 : 256x256, 1 밀리미터 슬라이스 두께 1mm 슬라이스 분리 뷰 (FOV)의 필드.
  5. 사후 조직학 : 10μm 두께 cryosection는 표현 eGFP과 청색 fluorescently 분류 BMSC U 동안 상영되었다형광 현미경을 노래.

figure-protocol-2
줄기 세포 이식의 그림 2. Multimodal 이미징

  1. 빙하 파란 (GB) 엠피오의 직접 immunofluorescence 현미경은 BMSC-Luc/eGFP을 분류.
  2. 4x10 5 주입된 생쥐의 생체내 BLI에서는 기가바이트 엠피오는 주 1 주입 후 주 2 시에 BMSC-Luc/eGFP 세포를 분류. 주 1, 주 2 사후 이식에서 발견 BLI 신호의 통계적 분석. 데이터가 5 분 기간 동안의 cm2 당 steradian 당 초 당 광자의 평균 개수 (산도 / S / SR / cm 2)로 표현됩니다 + / - 맑은 BLI 신호를 보여주는 생쥐의 관심을 고정 영역에서 계산된 표준 오차 사출 사이트.
  3. 그리고 레이블이 지정되지 않은 BMSC-L : 기가바이트 MPIO의 코로나 2 차원 MRI는 BMSC-Luc/eGFP를 ((I) T2-가중 스핀 에코 이미지 그리고 (ii) T2 *-가중 기울기 에코 영상 왼쪽 패널)로 분류UC / eGFP (오른쪽 패널 : (3) T2-가중 스핀 에코 영상과 (VI) T2 *-가중 기울기 에코 이미지) 마우스 뇌에 이식.
  4. 기가바이트 MPIO의 Histological 분석은 주 2 사후 주입에 BMSC-Luc/eGFP 이식이라는. eGFP - 표현 및 GB MPIO 분류 BMSC-Luc/eGFP 이식술의 지방화를위한은 (i) 직접 immunofluorescence 분석. 의 (2) 높은 배율 세부 사항은 (i). 기가바이트 MPIO의 주변에서 astrocytic 반흔 조직의 발전을 나타내는 GFAP 항원에 대한 (3) Immunofluorescent 염색법은 BMSC-Luc/eGFP 라벨. Iba-1 항원에 대한 (VI) Immunofluorescent 염색법, 침략을 나타내는 및 GB MPIO의 주변은 microglia 의해 BMSC-Luc/eGFP이라는.

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토론

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이 보고서에서는 면역 관할 생쥐의 CNS의 세포 이식의 세부 특성화 세 보완 이미징 modalities의 조합 (BLI, MRI 및 조직학)에 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 리포터 유전자 반딧불 루시페라제 및 eGFP, 및 GB 엠피오와 직접적인 셀 라벨과 유전자 조작을 바탕으로 세포의 리포터 유전자 라벨,의 조합이 생체내에서 줄기 세포 이식의 정확한 평가로 안내합니다.

BMSC의 입자 라벨은 음이온 표면 (카르 복실 대체)와 함께 기가바이트 MPIO 입자 크기 (1.63μm)이 아닌 phagocytic 세포 16-18하여 이러한 입자 endocytotic 이해를 촉진하기 위해 제안합니다. 그러나, 높은 상표 효율을 얻을 배양 시간이 셀 타입에 의존 것을 언급해야합니다. 예를 들어, phagocytic 세포 (macrophages 및 돌기 세포 등)보다 신속하게 이러한 입자를 internalize 수 있습니다 (0.5의 배양 시간 - 1 ...

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공개 사항

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저자는 이익 갈등을 선언 없습니다.

감사의 글

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작가의 작품 연구에 연구를 부여 G.0136.11 및 G.0130.11 의한 앤트워프 대학의 부여 ID-BOF 2006 (PPO와 AVdL 부여), (AVdL, ZB와 PPO 부여) 및 1.5.021.09에 의해 지원되었다. 과학 기술에 대한 플랑드르 연구소 BRAINSTIM (ZB와 AVDL 부여)보기 : 학술 연구 - 플랑드르 SBO 연구 기금 IWT-60838에 의한 (FWO-Vlaanderen, 벨기에)에 대한 기금의 N.00 (PPO에 부여) EC-FP6-가지고와 DiMI (LSHB-CT-2005-512146)에 의해 부분 플레미쉬 정부에서 Methusalem 연구 기금 (ZB 부여), EC-FP6-가지고와 에밀 (LSHC-CT-2004-503569)에 의한 부분 그리고 남북 대학 매력 폴란드에 의한 IUAP-NIMI-P6/38 (AVDL 부여). 나탈리 드 Vocht는 FWO-Vlaanderen에서 박사 학위 - 학생이기을 보유하고 있습니다. 피터 Ponsaerts는 FWO-Vlaanderen의 포스트 박사 동료입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
IMDM Lonza BE12-722F 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소
태아 소 혈청 Gibco 10270-106 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소
말 혈청 Gibco 1605-122 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소
페니실린 - 스트렙토 마이신 Gibco 15,140 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소
Fungizone Gibco 15290-018 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소
PBS Gibco 14,190
Puromycine Invivogen 개미-PR-1
트립신 Gibco 25,300
기가바이트 MPIO 앞머리 연구소 ME04F/7833
D-luciferin Promega E1601
케타민을 (Ketalar) 화이자
Xylazine (Rompun) 바이엘 헬스케어
Isoflurane Isoflo 05260-05
0.9 % NaCl 용액 벡스터
paraformaldehyde 머크 1.04005.1000
자당 Applichem A1125
미세 분사 펌프 KD 과학 KDS100
광자 영상기 Biospace 연구소
9.4T MR 스캐너 Bruker Biospin Biospec 20분의 94 USR
BX51 현미경 올림포스 산 BX51
Mycrom HM 그라 이오 스탯 Prosan HM525
주사기 해밀턴 7635-01
30 게이지 바늘 해밀턴 7762-03
포토 비전 소프트웨어 Biospace 연구소
M3vision 소프트웨어 Biospace 연구소
Paravision 5.1 소프트웨어 Bruker Biospin
Amira 4.0 소프트웨어 얼굴 이미징

참고문헌

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