생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
지난 10 년 동안 줄기 세포 이식은 잠복기 및 임상 연구에서 두 질환의 다양한 주 또는 보조 치료 양상 등의 증가하고 관심을 받고있다. 그러나, 기능적 결과 및 / 또는 조직 재생 다음과 줄기 세포 이식에 관한 결과가 매우 다양 날짜입니다. 일반적으로 임상 혜택은 기본 메커니즘 (들) 1의 깊은 이해없이도 관찰된다. 따라서 여러 노력은 정확하게 생존, 운명 및 이식할 줄기 세포 및 / 또는 그들의 마이크로 환경의 생리를 평가하는 데 궁극적인 목표로 이식 줄기 세포를 모니터링하는 다른 분자 이미징 modalities의 발전에 주도했습니다. 분자 이미징에 의해 결정 하나 이상의 매개 변수에서 관찰 변경 관찰된 임상 효과에 관한 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리의 연구는 bioluminescence 이미징의 통합 이용 (BLI), 자기 공명 영상 (MRI) 및 histological analysi에 초점S는 이식 줄기 세포를 평가합니다.
BLI는 일반적으로 비 invasively 세포 루시페라제-리포터 유전자를 표현하는 생화 학적 반응을 바탕으로 이식 2-7, 다음 셀 추적을 수행하고 시간에 세포 생존을 모니터링하는 데 사용되는 것은 그것의 기판에 빛을 다음과 같은 상호 작용을 방출 수 있습니다 (예 : D- luciferin) 8, 9. 반면 MRI는 민감도가 높은 MRI 대비 에이전트와 함께 세포 라벨 이후에 생성되는 반면에 달려 있지만, 10 임상 적용하고 정확하게 매우 높은 해상도를 11-15로 세포 이식을 찾습니다하는 데 사용할 수있는 비침습 기술이다 . 마지막으로, 사후 histological 분석은 높은 해상도와 감도있는 비침습 방법으로 얻은 연구 결과를 확인하기 위해 선택한 방법입니다. 또한 엔드 포인트 histological 분석은 우리가 이식할 세포 및 / 또는 주변 조직, 바의 상세한 phenotypic 분석을 수행할 수 있습니다형광 기자 단백질 및 / 또는 특정 항체와 직접 셀 라벨링의 사용에 SED.
요약하면, 우리는 여기에 시각적으로 서로 다른 줄기 세포 및 / 또는 환경 관련 생쥐의 CNS에서 이식 줄기 세포에 따라 특성을 해명하는 BLI, MRI 및 조직학의 complementarities를 보여줍니다. 예를 들어, 뼈가 골수는-파생된 유전자 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 반딧불 루시페라제 (fLuc) 및 청색 형광 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (MPIOs)로 레이블을 표현할 수 있도록 설계 stromal 세포를,에 이식할 예정 면역 - 관할 마우스 및 결과의 CNS는 BLI, MRI 및 조직학 (그림 1)에 의해 모니터링됩니다.
프로토콜
1. 셀 준비
- 실험은 유전자 루시페라제 및 eGFP 기자 단백질을 표현하는 설계 전직 생체내 교양 줄기 세포 인구를 사용하여 시작되어야합니다. 여기는 이전 Bergwerf 외. 2, 5에 기술된 / 루시페라제 eGFP - 표현 murine 골수 파생 stromal 세포 (BMSC-Luc/eGFP)을 사용합니다.
- 1 μg / ML의 Puromycine로 보충 15 ML 전체 확장 매체 (CEM)에 T75 문화 플라스크 당 8 × 10 5 세포의 밀도의 전지 라벨, 플레이트 BMSC-Luc/eGFP 세포 이틀전 일.
- 세포가 37에서 48 시간 동안 성장할 수 있도록 허용 ° C에서 5 % CO 2.
- 5 추가 X 10 6 빙하 블루 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (GB MPIO) 성장 세포 배양에 당 ML 배지 (총 : 75 × 10 T75 문화 플라스크에서 15 ML 문화 매체 당 6 입자).
- endocytosis를 통해 입자 이해 가능하도록 16 시간 동안 알을 품다.
- 남은 입자를 멀리 씻으그리고 세포에 GB MPIO의 세포 confluency 및 균질 분포를 얻기 위해....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 보고서에서는 면역 관할 생쥐의 CNS의 세포 이식의 세부 특성화 세 보완 이미징 modalities의 조합 (BLI, MRI 및 조직학)에 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 리포터 유전자 반딧불 루시페라제 및 eGFP, 및 GB 엠피오와 직접적인 셀 라벨과 유전자 조작을 바탕으로 세포의 리포터 유전자 라벨,의 조합이 생체내에서 줄기 세포 이식의 정확한 평가로 안내합니다.
BMSC의 입자 라벨은 음이온 표면 (카르 복실 대체)와 함께 기가바이트 MPIO 입자 크기 (1.63μm)이 아닌 phagocytic 세포 16-18하여 이러한 입자 endocytotic 이해를 촉진하기 위해 제안합니다. 그러나, 높은 상표 효율을 얻을 배양 시간이 셀 타입에 의존 것을 언급해야합니다. 예를 들어, phagocytic 세포 (macrophages 및 돌기 세포 등)보다 신속하게 이러한 입자를 internalize 수 있습니다 (0.5의 배양 시간 - 1 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이익 갈등을 선언 없습니다.
감사의 글
작가의 작품 연구에 연구를 부여 G.0136.11 및 G.0130.11 의한 앤트워프 대학의 부여 ID-BOF 2006 (PPO와 AVdL 부여), (AVdL, ZB와 PPO 부여) 및 1.5.021.09에 의해 지원되었다. 과학 기술에 대한 플랑드르 연구소 BRAINSTIM (ZB와 AVDL 부여)보기 : 학술 연구 - 플랑드르 SBO 연구 기금 IWT-60838에 의한 (FWO-Vlaanderen, 벨기에)에 대한 기금의 N.00 (PPO에 부여) EC-FP6-가지고와 DiMI (LSHB-CT-2005-512146)에 의해 부분 플레미쉬 정부에서 Methusalem 연구 기금 (ZB 부여), EC-FP6-가지고와 에밀 (LSHC-CT-2004-503569)에 의한 부분 그리고 남북 대학 매력 폴란드에 의한 IUAP-NIMI-P6/38 (AVDL 부여). 나탈리 드 Vocht는 FWO-Vlaanderen에서 박사 학위 - 학생이기을 보유하고 있습니다. 피터 Ponsaerts는 FWO-Vlaanderen의 포스트 박사 동료입니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 10270-106 | 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 |
| 말 혈청 | Gibco | 1605-122 | 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Gibco | 15,140 | 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 |
| PBS | Gibco | 14,190 | |
| Puromycine | Invivogen | 개미-PR-1 | |
| 트립신 | Gibco | 25,300 | |
| 기가바이트 MPIO | 앞머리 연구소 | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| 케타민을 (Ketalar) | 화이자 | ||
| Xylazine (Rompun) | 바이엘 헬스케어 | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9 % NaCl 용액 | 벡스터 | ||
| paraformaldehyde | 머크 | 1.04005.1000 | |
| 자당 | Applichem | A1125 | |
| 미세 분사 펌프 | KD 과학 | KDS100 | |
| 광자 영상기 | Biospace 연구소 | ||
| 9.4T MR 스캐너 | Bruker Biospin | Biospec 20분의 94 USR | |
| BX51 현미경 | 올림포스 산 | BX51 | |
| Mycrom HM 그라 이오 스탯 | Prosan | HM525 | |
| 주사기 | 해밀턴 | 7635-01 | |
| 30 게이지 바늘 | 해밀턴 | 7762-03 | |
| 포토 비전 소프트웨어 | Biospace 연구소 | ||
| M3vision 소프트웨어 | Biospace 연구소 | ||
| Paravision 5.1 소프트웨어 | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 소프트웨어 | 얼굴 이미징 |
참고문헌
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
