연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

요약

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다 Aplysia. 우리는 이미지 세포 내 칼슘을 형광 염료, 칼슘 오렌지, 그리고 날카로운 (세포) 전극과 신경 전달을 유도하고 모니터링을 사용합니다.

초록

그것은 세포 내 칼슘의 변화는 시냅스 소성 (예를 들어, homosynaptic 촉진) ^1의 중요한 형태의 수의 유도를 중재하는 것이 좋습니다되었습니다. 이 가설이 동시에 세포 내 칼슘의 변화와 신경 효능에 변경을 모니터링하여 테스트 할 수 있습니다. 우리가이 세포 내 기록 기술을 칼슘 이미징를 조합하여 수행 할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리 실험은 연체 동물 Aplysia californica의 구강 신경절로 진행됩니다. 이 준비가 실험적으로 유리한 특징을 가지고 : 신경절 쉽게 Aplysia에서 제거 실험 일반 시냅스 연결을 확인하고 정상 이온 채널 유통이 성인 뉴런을 사용 할 수 있습니다. Aplysia에 대한 자연 동물의 낮은 신진 대사 속도와 상대적으로 낮은 온도 (14-16 ° C)로 인해 준비는 오랜 기간 동안 안정적입니다. 이 긴 파장 형광 염료는 칼슘에 바인딩 할 때 우리가 쉽게 iontophoresis를 통해 신경 세포로 '로드'이다 칼슘 오렌지 ^2의 셀 impermeant 버전을 사용합니다 세포 무료로 칼슘의 변화를. 감지 할 다닐 ">, 형광 강도가 증가. 칼슘 오렌지가 빠른 운동 특성 ^3는 ratiometric 염료와는 달리 (예를 들어, Fura 2), 영상에 대한 필터 휠을 필요하지 않습니다. 그것은 안정적이고 다른 염료 (예를 들어, fluo-3) ^2,4 이하 phototoxic 상당히 사진입니다. 모든 비 ratiometric처럼 이 로딩 및 확산으로 인한 염료 농도의 변화에​​ 대한 계정 수 없기 때문에 염료는 칼슘 오렌지, 칼슘 농도의 상대적인 변화를 나타냅니다. 그러나, 그것은 절대 칼슘 농도를 제공하기 위해 보정 할 수 없습니다.

수직, 고정 무대, 복합 현미경은 초당 30 프레임 주위에 녹화 할 수있는 CCD 카메라로 이미지 뉴런에 사용되었습니다. Aplysia이 시간적 해상도에서세포 내 칼슘 농도에서도 하나의 스파이크 유도 변경을 감지하기에 충분한 이상이다. 샤프 전극을 동시에 식별 사전 및 postsynaptic 뉴런에서 신경 전달을 유도하고 기록하는 데 사용됩니다. 각 시험의 결론에서, 사용자 정의 스크립트가 전기 생리학 및 이미징 데이터를 결합합니다. 적절한 동기화를 보장하기 위해 우리는 현미경의 카메라 포트에 장착 LED에서 빛 펄스를 사용합니다. presynaptic 칼슘 레벨 (세포 EGTA 주입을 통해 예를 들어)의 조작은 우리가 소성의 다양한 형태의 중재에 세포 내 칼슘의 역할에 관한 구체적인 가설을 테스트 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비하기

1. 75-100 ML 등장 염화 마그네슘 용액을 주입하여 동물을 마취. 우리는 이미지에 사용 Aplysia은 일반적으로 150-200그램하고 Marinus 과학에서 얻을 수 있습니다.
2. 왁스 대상 접시에 anesthetized 동물을 핀. 주사기 바늘은이 목적을 위해 잘 작동, 멸균 기술은 필요하지 않습니다. 총 포셉 및 표준 가위를 사용하면 동물의 발에 절개를하고 구강 질량을 쉽게받을 수 있습니다. 구강 신경을 찾습니다. 모든 구강 신경을 절단하여 신경을주의 깊게 무료, 스프링 가위와 고급 포셉을 사용합니다.
3. 신경을 제거하고 인공 해수를 포함하는 Sylgard 코팅 접시에 배치합니다. 신경을 안정 구강 신경을 통해 몇 곤충 핀을 배치합니다. Desheath 세포 녹화 뉴런을 노출 초 미립 포셉, 봄의 가위, 수 있도록 사용하여 구강 신경절. 그런 다음 15 고급 벌레를 (사용하여 신경을 다시 핀 분utien) 핀. 모든 운동은 영상 중에 문제가 될 것 같은 신경이 곳에서 단단히 개최해야합니다.

2. 전극을 준비

1. 필라멘트와 유리 모세관 튜브를 사용하여 전극 (예 : WPI TW100F-4)와 풀러를 당겨. 설정은 개별적으로 필요한....

토론

우리는 동시에 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하고 신경 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수있는 기술을 보여줍니다. 이 기술은 단기 소성의 다양한 형태가 중재하는 방법을 결정하는 데 유용합니다.

영상은 형광 현미경과 CCD 카메라로 수행됩니다. 대부분의 기능 이미징 세트 업에 비해이 장비 요구 사항은 상대적으로 겸손입니다. 기술은 간단하고 배우기 쉽다. CCD 카메라와 영상 좋은 시간적 해상도를 가진 넓은 지역의 시각화를 허용하지만, 공간 해상도가 제한됩니다. 따라서 세포 내 칼슘의 상대적으로 광범위한 또는 '배경'증가의 역할에 관한 테스트 가설에 유용한 기술입니다. 쪽의 공간 해상도와 학습 칼슘 역학을 개선하기 위해, 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경, 또는 두 광자 현미경과 칼슘 표시기 칼슘 그린을 그냥 할 수프로토콜 ¹⁰ 만 약간의 수정과 함께 사용할 수.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 이름	회사	카탈로그 번호	논평
칼슘 오렌지	Invitrogen	C-3013
EGTA	시그마	E-4378
칼슘 보정 버퍼 키트	Invitrogen	C-3008MP	신호의 감도와 동적 범위를 테스트하는 데 유용
마그네슘 염화물 hexahydrate	시그마	M0250	동물을 마취하는 0.33 M 용액에 사용

장비 명	회사	논평
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NMN-21 manipulators	Narishige	자석으로 무대에 장착
CoolSNAP HQ 두 CCD 카메라	Photometrics
NIS 요소 AR (버전 3.22)	니콘 인스트루먼트	이미징 소프트웨어는 형광 데이터를 수집하는 데 사용
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