전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs)는 blastocyst 절연 1 일 이후 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 문화를 확립하는 데 사용되었습니다. 이 피더 시스템은 셀 확장하는 동안 자연스럽게 차별화를 겪고에서 hESCs을 유지합니다. 그러나이 공동 문화에있어서, 집중적 인 노동이 고도로 숙련 된 인력을 필요로하고, 수율 낮은 hESC의 순도 4. 많은 실험실 hESC 문화의 피더 세포의 수를 (즉, 매트릭스 코팅 요리 또는 기타 피더 세포 유형 5-8을 포함) 최소화하기 위해 시도했습니다. 이러한 수정 문화 시스템은 몇 가지 약속을 표시했지만, 미토 마이신 C-처리 마우스 embyronic의 섬유 아세포로 배양의 hESCs hESC 문화의 원치 않는 자연 차별화를 병신하기 위해에 대한 표준 방법을 supplanted 없습니다. 따라서, hESC 확장에 사용되는 피더 세포는 분화 실험을하는 동안 제거해야합니다. 여러 기술 hESC의 공동 정화에 사용할 수 있지만피더에서 lonies은 (FACS, 맥, 또는 약물 내성 벡터의 사용), 이러한 기술은 노동 집약적 인 비용 및 / 또는 hESC에 파괴됩니다. 이 프로젝트의 목적은 hESCs의 순수한 인구의 수확을 가능하게 정화하는 방법을 발명하는 것이 었습니다. 우리는 합류 hESC 문화에서, MEF 인구는 MEF 시트의 간단하고 빠른 흡인을 사용하여 제거 할 수 관찰했다. 이 제거 "측면 휴대 전화의 스티렌 배양 접시에 낮은 바인딩 친화력을 가지고 MEFs의 결합, 그리고 자신의 세대 동안 바깥쪽으로 섬유 아세포를 누르는 줄기 세포 콜로니의 능력 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다 틈새 ". hESC 그런 다음 pluripotency의 유지 보수를 보장하기 위해 MEF 제거 후 10 일 SSEA-4, Oct3 / 4, Tra 1-81 표현에 조사되었다. 또한, hESC의 식민지는 hESC 확장의 추가 레벨을 제공 MEF 제거 후 큰 형태로의 성장을 계속 할 수있었습니다.
프로토콜
1. 마우스 배아 공급기의 작성
- hESCs의 공동 문화에 사용되는 MEFs는 이전에 다음 부서를 겪고에서 세포를 억제하기 위해 조사 또는 미토 마이신-C에 의해 처리되어야합니다.
- MEF를 심는 이전 두 시간, 코트는 각 60mm 플라즈마는 0.05 % 젤리 2 ML과 문화 요리를 취급.
- 처리 MEFs의 약병과 ~ 20,000 세포 / cm 2에 판을 해동.
- 세포가 밤새 준수 할 수 있도록 허용합니다.
2. MEFs로 공동 심는 hESCS
- 새로운 식민지는 다음과 같이 새로운 MEF-코팅 요리에 cryopreserved 문화 나 passaging 현재 문화에서 시작 될 수 있습니다.
- 예열 1X PBS의 3 ML로 1 회를 passaged 할 큰 hESC의 식민지가 들어있는 판을 씻으십시오.
- Collagenase IV / PBS 용액 (1 MG / ML) 3 ML을 추가하고 37 5-10 분 동안 품다 ° C. (참고 : 세포가 뚜렷한이나 공 등의 트립신으로 본이되지 않습니다.)
- 세포는 아직있는 동안collagenase, 5 ML의 pipet 팁의 가....
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토론
이 논문에 제시된 방법은 인간 배아 세포 문화에서 섬유 아세포 피더 세포를 제거에 신속하고 적은 비용이 많이 드는 대안을 제공합니다. 섬유 아세포의 성공적인 제거 더 이상 줄기 세포 문화에 개발이 세포의 단단히 합류 monolayer의 존재에 따라 달라집니다. 7~10일 후, 성장 hESC의 식민지는 식민지 사이에 점점 더 조밀 한 섬유 아세포 monolayer를 생성, 바깥 방향으로 피더 섬유 아세포를 밀어 것입니다. 섬유 아세포 monolayer에서 강력한 휴대 전화 첨부 파일은 셀 시트 등의 빠른 제거를 할 수 있습니다. 그것은이 정화 기술은 이전 루틴을 확장 문화 활용 만이 아니라 실험에 hESC에서 MEF 제거의 방법으로 사용하기 위해 추천되는주의 깊게 주목해야한다.
그것은 품질이 낮은 줄기 세포 식민지를 구출이 정화 기술을 활용하는 것도 가능합니다. 고품질의 hESC의 식민지 disti을 전시한다자신과 피더 세포 사이의 경계를 nct. 그러나, 줄기 세포 식민지는이.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 재생 의료의 캘리포니아 연구소 (RN2 - 00921-1) 및 NIH 투자 국가 연구 상 (F32-HL104924)에서 새로운 교수 상 II가 추진하는 사업
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| DDR2 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) | 7555 | 섬유 아세포 마커 |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | 세포 핵 마커 |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | 인간 ESC 마커 |
| Oct 4분의 3 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) | 9081 | 인간 ESC 마커 |
| Flk-1 | BD 제약 | 555307 | 조기 차별화 마커 |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | 인간 ESC 마커 |
표 1. 특정 정말이에요 표신사는 hESC를 immunostaining에 사용됩니다.
참고문헌
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blas....
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재인쇄 및 허가
