이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을 확장 1.
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이 논문에서
요약
초록
년간 천연 고분자로 인해 자신의 호스트 biocompatibility 및 시험 관내 및 생체내의 세포와 상호 작용하는 능력의 중요성을 얻고있다. 재생 의료의 가능성을 가지고 연구의 영역이 소설 biomaterials 및 줄기 세포의 조합을 사용합니다. 조직 공학 분야의 기본적인 전략은 세포 기능을 감독을위한 입체 비계 (예 : 세포외 기질, hydrogels, 마이크로 / 나노 입자를 decellularized)의 사용이다. 이 기술은 세포, 그들은 고수 수있는시 기판이 필요 분아 따위에 의해 중식, 그들의 차별화된 세포 표현형 및 기능 2-3 표현하는 발견으로 변화시켰습니다. 최근에는, 그것은 또한 세포 부착에 대해 이러한 기판을 사용할뿐만 아니라 상호 작용 및 매트릭스 기판 (예 : 세포외 기질, ECM) 4에서 단서를뿐만 아니라 결정되었습니다. 따라서 세포 공사장 공중 발판은 상호 연결조직 개발, 조직, 그리고 궁극적인 기능을 제어하는 역할을합니다. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs)가 mesenchymal가 아닌 hematopoetic 줄기 세포 멀티 혈통 차별을 전시하고 세포 즉시 사용할 소스 (예 : 사전 혈관 endothelia 및 pericytes)으로 사용할 수있는 지방 조직에 존재한다. 우리의 가설은 지방 파생 줄기 세포가 bilayered 매트릭스 1에 간단히 공동 culturing 그들에 의해 동시에 phenotypes 서로 다른 방향으로 이동 수있다는 것입니다. 저희 실험실은 피부 상처 치유에 초점을 맞추었습니다. 이를 위해, 우리는 피부에 특정한 상처 치유 ECM 환경의 특성과 기능을 모방 수있는 하나의 복합 천연 biomaterials의 행렬, 섬유소, 콜라겐과 키토산을 만들었습니다.
프로토콜
1. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs) 1, 5를 분리해
주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.
- 쥐 perirenal 및 epididymal 지방 격리하고 앞에서 설명한 5로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. 이 연구는 동물 복지 법, 구현 동물 복지 규정 및 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 원칙에 따라 준수 실시되었습니다.
- 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HBSS의 25 ML에 1-2g을 전송.
- 자유 부동 지방 조직 계층과 125-ML Erlenmeyer 플라스크에 송금을 모아서 37시 45 분 대한 HBSS에서 collagenase 2 형 (200 U / ML)의 25 ML ° 궤도 흔드는 (125 RPM)에서 C로 취급합니다.
- 조심스럽게 pipeting에 의해 액체 분획을 (오일과 지방 레이어 아래)을 제거하고 100를 통해 순차적으로 그것을 필터링 - μm의 70 - μm의 나일론 메쉬 필터. 상온에서 10 분 동안....
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토론
ASCs은 고립과 다양한 세포 유형으로 차별화할 수있는 능력 자신의 용이성에 대해 잘 알려져 있습니다. 본 원고에서 설명한 기법을 통해, 우리는 동시에 여러 biomatrices 이러한 세포를 노출함으로써 ASCs의 소성을 이용하실 수 있습니다. 세포가 자신의 CSM베이스에서 떨어져 마이 그 레이션과 그 주변의 세포외 환경을 입력할 때, 세포는 비계에서 실수를 타고 중 "stemness"(콜라겐)을 유지하거나 혈관 및 혈관 -지지 세포 유형 (섬유소)를 향해 차별 유도되. 우리 연구소는 피부와 부드러운 조직 상처 치유에 관심이 있기 때문에, 우리는 전략적으로 섬유소가 자연스럽게 혈관 네트워크를 형성 9 유도 반면 콜라겐은 호스트에 의해 피부 및 표피의 재생을 지원하기 때문에 콜라겐과 섬유소의 이중층을 구현. 또한, 그것은 이제 크로스 이야기가 피부 keratinocytes, fibroblast, 그리고 근본적인 혈관 네트워크를 proliferating 사이에서 발생하는 이해하며,이 복잡한메.......
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공개 사항
어떤 경쟁하는 금융 이익은 존재하지.
유의 사항
여기에 포함된 의견이나 주장은 저자의 개인 의견이며 공식이나 국방 또는 미국 정부 부서의 의견을 반영 해석할 수 없습니다. 저자는 미국 정부의 직원이며,이 작품들은 공무의 일환으로 준비되었다. 모든 작품은 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령에 의해 지원되었다. 이 연구는 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령 기관 심사위원회 및 승인 절차에 따라 검토와 승인 절차하에 실시되었다.
감사의 글
SN은 피츠버그 조직 공학 이니셔티브에서 박사 과정 이수 화목 그랜트에 의해 지원되었다. DOZ는 제네바 재단에서 수여 교부금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 장비의 명칭 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS) | Gibco | 14,175 | 소모품 |
| 태아 소 혈청 | Hyclone | SH30071.03 | 소모품 |
| Collagenase 타입 II | 시그마 - 올드 리치 | C6685 | 소모품 |
| 70 μm의 나일론 메쉬 필터 | BD Biosciences | 352,350 | 소모품 |
| 100 μm의 나일론 메쉬 필터 | BD Biosciences | 352,360 | 소모품 |
| MesenPRO 성장 매체 시스템 | Invitrogen | 12746-012 | 소모품 |
| L-글루타민 | Gibco | 25,030 | 소모품 |
| CaCl 2 0.2 H 2 O | 시그마 | C8106 | 소모품 |
| T75 조직 배양 플라스크 | BD Biosciences | 137,787 | 소모품 |
| 키토산 | 시그마 - 올드 리치 | 448,869 | 소모품 |
| 초산 | 시그마 - 올드 리치 | 320,099 | 소모품 |
| N-Octanol | Acros의 생명체 | 150,630,025 | 소모품 |
| 솔비 - 모노 Oleate | 시그마 - 올드 리치 | S6760 | 소모품 |
| 수산화 칼륨 | 시그마 - 올드 리치 | P1767 | 소모품 |
| 아세톤 | 피셔 과학 | L-4859 | 소모품 |
| 에탄올 | 시그마 - 올드 리치 | 270,741 | 소모품 |
| Trinitro Benzenesulfonic 산성 | 시그마 - 올드 리치 | P2297 | 소모품 |
| 염산 | 시그마 - 올드 리치 | 320,331 | 소모품 |
| 에틸 에테르 | 시그마 - 올드 리치 | 472-484 | 소모품 |
| 8 μm의 조직 문화 플레이트 삽입물 | BD Biosciences | 353,097 | 소모품 |
| 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 | 어부 | 05-408-129 | 소모품 |
| MTT 시약 | Invitrogen | M6494 | 소모품 |
| 디메틸 Sulfoxide | 시그마 - 올드 리치 | D8779 | 소모품 |
| Qtracker 셀 라벨 키트 (Q트래커 655) | 분자 프로브 | Q2502PMP | 소모품 |
| 한 콜라겐을 입력 | Travigen | 3447-020-01 | 소모품 |
| 수산화 나트륨 | 시그마 - 올드 리치 | S8045 | 소모품 |
| 12 음 조직 배양 플레이트 | BD Biosciences | 353,043 | 소모품 |
| 피브리노겐 | 시그마 | F3879 | 소모품 |
| 트롬빈 | 시그마 | T6884 | 소모품 |
| 폴리에틸렌의 Benztriazole 금지 | Sunbio | DE-034GS | 소모품 |
| 트리스 버퍼 타블렛 (산도 7.6) | 시그마 | T5030 | 소모품 |
| 원심 분리기 | Eppendorf | 5417R | 동등pment |
| 궤도 흔드는 | 뉴 브 런 즈윅 Scienctific | C24 | 장비 |
| 에어 5 % CO 2와 Humidified 인큐베이터 | 써모 과학 | 모델 370 | 장비 |
| 오버헤드 활동가 | 이카 | Visc6000 | 장비 |
| 마그네틱 활동가 | 코닝 | PC-210 | 장비 |
| 진공 건조기 | - | - | 장비 |
| 입자 크기 분석기 | Malvern | STP2000 Spraytec | 장비 |
| 열탕 목욕 | 피셔 과학 | Isotemp210 | 장비 |
| 분광 | Beckman | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 DU 800UV/Visible 분광 | 장비 |
| 와동 | Diagger | 3030a | 장비 |
| Microplate Reader를 | 분자 장치 | SpectraMax M2 | 장비 |
| 형광 / 라이트 현미경 | 올림포스 산 | IX71 | 장비 |
| 공촛점 현미경 | 올림포스 산 | 공촛점 현미경 스캐닝 FV-500 레이저 | 장비 |
| 전자 현미경 검사 | 칼 자이스 혈구 MicroImaging | 레오 435 부사장 | 장비 |
| 전송 전자 현미경 | JEOL | JEOL 1230 | 장비 |
참고문헌
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S.
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