위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

요약

여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을 나타냅니다 예 생체 시스템입니다. 췌장 꽃 봉오리의 explants는 며칠 동안 배양 및 전체 마운트 immunofluorescence, 라이브 영상 등의 다양한 응용 프로그램의 범위에서 사용할 수 있습니다.

초록

췌장은 소화 효소와 혈당 수치 ¹ 규제의 생산을 포함한 우리 몸의 중요한 기능을 제어합니다. 지난 십 년간 많은 연구가 췌장 organogenesis을 이해하기위한 견고한 기초에 공헌했지만, 중요한 틈 초기 췌장 ^형성이 우리의 지식에 유지됩니다. 이러한 초기 이벤트의 전체 이해는이 기관의 개발에 대한 통찰력을 제공하지만, 또한 당뇨병이나 췌장암으로 췌장를 타겟팅하는 불치의 질병으로합니다. 마지막으로,이 정보는 당뇨병의 맥락에서 세포 교체 요법을 개발하기위한 청사진을 생성합니다.

embryogenesis 동안, 췌장 배아 일의 등쪽과 복부 foregut의 endoderm 마우스 배아 ^3,4에서 (E) 9.5의 고유 한 배아 outgrowths에서 유래 된 것입니다. 두 outgrowths은 단단한 상피 조직으로 주변 mesenchyme에 evaginate완전히 성숙 장기 ^2,5,6을 생성하기 위해 분기와 차별화, 확산을 받아야 난 꽃 봉오리. 최근 증거는 인슐린 생산 β-세포 등의 췌장 세포 lineages, 성장과 차별화는 분기 췌장 상피 ^7,8 내의 적절한 조직 아키텍처, 상피 리모델링 및 셀 위치에 따라 달라집니다 것을 제안했습니다. 그러나, morphogenesis을 가지 방법을하면 발생 췌장의 증식과 분화로 조정됩니다 것은 대부분 알 수 있습니다. 이 morphogenetic 이벤트는 매우 동적 한편 개발 프로세스에 대한 최신 지식, 고정 표본의 분석에 거의 대부분 의존 하였다는 사실로 인해 일부입니다.

여기, 우리는 해부 및 개발 췌장 (그림 1)를 직접 시각화를 허용 유리 바닥 요리에 배양 마우스 배아 췌장 꽃 봉오리의 예를 생체에 대한 방법을보고합니다. 이 컬트우레 시스템은 이상적으로 특히, 라이브 셀 이미징에 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 위해 고안하고 있습니다. 췌장 explants가 아니라 야생 타입 마우스 배아에서 준비뿐만 아니라, 유전 공학 마우스 변종 (예 : 유전자 변형 또는 녹아웃)에서 돌연변이 phenotypes의 실시간 연구를 허용 할 수 있습니다. 또한,이 전 생체 문화 시스템은 증식과 성장, 연신율, 브랜칭, tubulogenesis과 차별화에 대한 정량적 데이터를 얻을 수있게 췌장 개발에 화학 화합물의 효과를 연구 할 가치가있다. 결론적으로, 고해상도 영상과 함께 전직 생체의 췌장 explant 문화 방법의 개발은 그들이 개발 마우스의 배아에서 발생하는 morphogenetic과 차별화 이벤트를 관찰위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 프로토콜은 원래 퍼시벌과 슬랙 ⁹ 설명 및 공 촛점 현미경에 최적화 된 기술로 조정되었습니다.

1. 유리 바닥 문화 요리의 코팅

다음 단계는 층류 후드에 무균 조건 하에서 수행되어야한다.

1. 췌장 explants는 20 mm 직경 유리 microwell 하단에 (예 : MatTek 공사)와 35 mm 배양 접시에 배양되어 있습니다. explant 문화 당과 문화의 전체 기간에 대해 하나의 유리 바닥 요리를 사용합니다. 췌장 꽃 봉오리, 코트 fibronectin과 유리 바닥 microwells의 해부 및 절연 전날 있습니다.
2. 50 μg / ML 최종 농도로 세포 문화 수준의 물에 살균 fibronectin을 희석하여 전체 유리 표면 (그림 1E)를 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 최소 볼륨을 (~ 150 μl)를 추가합니다. 요리를 놓으십시오밤새 잠복을위한 4 ° C 냉장고 인치
3. 해부의 날, fibronectin을 기음 세포 문화 수준의 물 microwell을 씻어 BME 150 μl (자연적으로 흐르는 것과 중 이글) 펜 /....

토론

췌장의 운명이 지정되면, 췌장 전구 세포는 결국 성숙하고 기능 오르간 ^2,4를 형성하기 위해 광범위한 확산, 차별화 및 morphogenesis을 받고있다. 현재 분기하는 방법은 췌장에서 일어난 방법은 전구 증식과 분화에 연결되어 대부분 알 수 있습니다. 췌장 explant 문화는 이러한 프로세스에게 예 생체 ^5,9,11을 명료하게하다 할 수있는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 초기 췌장 꽃 봉오리의 전 생체의 explants과 라이브 셀 이미징을 결합하여 하나는 배아의 췌장의 morphogenesis 동안 개최 이벤트의 명확한 그림을 얻을 수 있습니다. 이 비디오 문서는 전체 마운트 immunofluorescence 및 라이브 이미지에 이상적 만드는 유리 지원에 배아 췌장의 전 생체 문화를 확립하는 간단한 방법을 제공합니다.

이미징 C에 대한 예 생체의 췌장 explants.......

재료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
항체 : Carboxypeptidase E-cadherin F-고를 글루카곤 인슐린 β1-인테그린 Pdx1 Pdx1 Phospho-히스톤 H3	아브드 Serotec Invitrogen 분자 프로브 ImmunoStar Millipore Millipore Abcam 하이 브리 도마 은행 셀 Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20,076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
기저 매체 독수리 (BME)	시그마	B1522-500ML	멸균 조건에 보관
세포 배양 등급 물	PAA	S15-012	멸균 조건에 보관
문화 요리 (유리 바닥), 35-mm	MatTek 공사	P35G-0-20-C
당나귀 세럼	Chemicon	S30-100 ML
태아 송아지 혈청 골드	PAA	A15-151	멸균 조건에 보관
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	주식 솔. 세포 배양 등급 물 1 MG / ML
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	멸균 조건에 보관
글루타민	Invitrogen	25030-024	멸균 조건에 보관
4 잘 Multidishes	Nunc	176740
현미경 : 역 공 촛점 현미경 (LSM 700) Stereomicroscope (디스커버리 V12)	Zeiss Zeiss		목표 : C-고차 색지움 0.45 / 10X W M27 (work. 지구 1.8 mm,. 이미징 깊이 ~ 100 ㎜), C-고차 색지움 1.2 W Corr M27 (work. 지구 0.28 mm., ~ 영상 깊이 50 μm) / 40X 위에서 아래에서 광섬유 조명의 Transillumination
Paraformaldehyde	로스	0335.3	증권 솔루션 20%
파스퇴르 Pipet (유리), 150mm	VWR	HECH567 / 1
페니실린 / 스트렙토 마이신	PAA	P11-010	멸균 C에 보관onditions
배양 접시, 60mm	Greiner 바이오 하나	628102
배양 접시, 35mm	Greiner 바이오 하나	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	멸균 조건에 보관
봄 가위 8mm 블레이드가 휘어	정밀 과학 도구	15023-10
트리톤 - X100	로스	3051.3
시계 제조 인의 foreceps 뒤몽 # 5	로스	K342.1