여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을 나타냅니다 예 생체 시스템입니다. 췌장 꽃 봉오리의 explants는 며칠 동안 배양 및 전체 마운트 immunofluorescence, 라이브 영상 등의 다양한 응용 프로그램의 범위에서 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
췌장은 소화 효소와 혈당 수치 1 규제의 생산을 포함한 우리 몸의 중요한 기능을 제어합니다. 지난 십 년간 많은 연구가 췌장 organogenesis을 이해하기위한 견고한 기초에 공헌했지만, 중요한 틈 초기 췌장 형성이 우리의 지식에 유지됩니다. 이러한 초기 이벤트의 전체 이해는이 기관의 개발에 대한 통찰력을 제공하지만, 또한 당뇨병이나 췌장암으로 췌장를 타겟팅하는 불치의 질병으로합니다. 마지막으로,이 정보는 당뇨병의 맥락에서 세포 교체 요법을 개발하기위한 청사진을 생성합니다.
embryogenesis 동안, 췌장 배아 일의 등쪽과 복부 foregut의 endoderm 마우스 배아 3,4에서 (E) 9.5의 고유 한 배아 outgrowths에서 유래 된 것입니다. 두 outgrowths은 단단한 상피 조직으로 주변 mesenchyme에 evaginate완전히 성숙 장기 2,5,6을 생성하기 위해 분기와 차별화, 확산을 받아야 난 꽃 봉오리. 최근 증거는 인슐린 생산 β-세포 등의 췌장 세포 lineages, 성장과 차별화는 분기 췌장 상피 7,8 내의 적절한 조직 아키텍처, 상피 리모델링 및 셀 위치에 따라 달라집니다 것을 제안했습니다. 그러나, morphogenesis을 가지 방법을하면 발생 췌장의 증식과 분화로 조정됩니다 것은 대부분 알 수 있습니다. 이 morphogenetic 이벤트는 매우 동적 한편 개발 프로세스에 대한 최신 지식, 고정 표본의 분석에 거의 대부분 의존 하였다는 사실로 인해 일부입니다.
여기, 우리는 해부 및 개발 췌장 (그림 1)를 직접 시각화를 허용 유리 바닥 요리에 배양 마우스 배아 췌장 꽃 봉오리의 예를 생체에 대한 방법을보고합니다. 이 컬트우레 시스템은 이상적으로 특히, 라이브 셀 이미징에 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 위해 고안하고 있습니다. 췌장 explants가 아니라 야생 타입 마우스 배아에서 준비뿐만 아니라, 유전 공학 마우스 변종 (예 : 유전자 변형 또는 녹아웃)에서 돌연변이 phenotypes의 실시간 연구를 허용 할 수 있습니다. 또한,이 전 생체 문화 시스템은 증식과 성장, 연신율, 브랜칭, tubulogenesis과 차별화에 대한 정량적 데이터를 얻을 수있게 췌장 개발에 화학 화합물의 효과를 연구 할 가치가있다. 결론적으로, 고해상도 영상과 함께 전직 생체의 췌장 explant 문화 방법의 개발은 그들이 개발 마우스의 배아에서 발생하는 morphogenetic과 차별화 이벤트를 관찰위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.
프로토콜
여기에 설명 된 프로토콜은 원래 퍼시벌과 슬랙 9 설명 및 공 촛점 현미경에 최적화 된 기술로 조정되었습니다.
1. 유리 바닥 문화 요리의 코팅
다음 단계는 층류 후드에 무균 조건 하에서 수행되어야한다.
- 췌장 explants는 20 mm 직경 유리 microwell 하단에 (예 : MatTek 공사)와 35 mm 배양 접시에 배양되어 있습니다. explant 문화 당과 문화의 전체 기간에 대해 하나의 유리 바닥 요리를 사용합니다. 췌장 꽃 봉오리, 코트 fibronectin과 유리 바닥 microwells의 해부 및 절연 전날 있습니다.
- 50 μg / ML 최종 농도로 세포 문화 수준의 물에 살균 fibronectin을 희석하여 전체 유리 표면 (그림 1E)를 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 최소 볼륨을 (~ 150 μl)를 추가합니다. 요리를 놓으십시오밤새 잠복을위한 4 ° C 냉장고 인치
- 해부의 날, fibronectin을 기음 세포 문화 수준의 물 microwell을 씻어 BME 150 μl (자연적으로 흐르는 것과 중 이글) 펜 / 패 혈성 (1 %), 글루타민 (1 %로 보충 매체의 최소 볼륨을 추가 ) 50 μg / ML Gentamicin [분해 매체]. 판 explants을 준비 할 때까지 층류 후드에 코팅 요리를 둡니다.
모든 fibronectin 코팅 요리를 사용하는 경우는 4 ° C.에서 1 주일에 저장 될 수 요리, 건조 분해 매체로를 입력하고 냉장고에 넣어 두지 마십시오.
fibronectin뿐만 아니라, 췌장 explants이 성공적으로 이러한 laminin 9 matrigel 10,11 또는 미세 멤브레인 12 다양한 기판에 배양되었습니다. 때문에 분기에 미치는 영향, 우리는 기판으로 fibronectin 9를 사용합니다.
2. D의 해부E11.5에서 orsal 췌장 버드 - E12.5 마우스 태아
- 배아 일 (E) 11.5 또는 12.5에서 시간 제한이 초과 임신 여성 쥐들이 희생되고 배아는 이전에 70 %의 에탄올과 청소 해부 악기를 사용하여 수집하고 있습니다. 50 μg / ML의 gentamicin과 보충 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 10 cm 플레이트에서 해부 자궁를 놓습니다.
- 부드럽게 decidua에 둘러싸여 거리에 자궁 근육과 각각의 배아를 제거 껍질을 벗기면 작은 가위 또는 뒤몽의 집게를 사용하여 개별 배아 세그먼트에 위, 별도의 자궁에서 조명과 stereomicroscope 아래. 배아를 노출하고 난황 주머니와 양막을 제거하는 13 표준 배아 분해 기술을 사용합니다. 그 후, 배의 상부 기관 (간 위)과 꼬리 영역을 제거합니다. 이 내부 장기 (그림 1B)의 노출을 할 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 BME의 해부 매체를 포함하는 10 cm 플레이트에 태아의 중간 몸을 전송합니다.
- 지금시각화하고 stereomicroscope 아래 등쪽 췌장 꽃 봉오리를 해부 아래에서 단 transillumination을 사용합니다. 부드럽게, 집게와 측면 절개를하여 배의 중간 몸을 엽니 다. 위와 비장을 찾습니다. 등쪽 췌장 봉오리 위의 뒤쪽 지역 (그림 1C)에 옆으로 부착된다. 뒤몽의 집게를 사용하여, 이러한 위장과 비장 등의 인접 구조에서 등쪽 췌장 꽃 봉오리을 멀리 해부하지만, (그림 1D) 상피 주위에 몇 가지 mesenchyme 둡니다. 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 10 % 태아 송아지 혈청 [문화 매체]로 보충 차가운 BME의 해부 매체를 포함하는 35 mm 페트리 접시에 격리 된 맥주를 전송할 수 있습니다. 모든 pancreata이 분리 될 때까지이 단계를 반복합니다. 다른 genotypes의 pancreata 고립 된 경우,이를 Nunc 4 잘 접시를 사용하여 별도의 유지.
3. 췌장 Explants의 도금과 문화
최종 오십시오explants의 ING는 문화의 신체적 인 움직임을 최소화하기 위해 조직 문화 공간 및 / 또는 조직 문화 인큐베이터에서 가까운 거리에 수행됩니다.
- 층류 흐름 후드의 무균 조건 하에서 BME 문화 매체의 150 μl와 fibronectin - 코팅 MatTek 요리 37 미리 예열 ° C.에 BME 분해 매체를 대체
- 조심스럽게, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 장기 문화의 코팅 MatTek 요리 (요리 당 하나의 explant)로 췌장 explants를 전송할 수 있습니다. 문화 중에 확산되도록하려면 explants을 둘러싼 mesenchyme가 약간 좋은 바늘로 필요한 경우, 찢어진 할 수 있습니다.
- 부드럽게, 조직 문화 인큐베이터에있는 문화 장소 (37 ° C, 5퍼센트 CO 2) explants가 유리 하단 microwells에 부착하게하는 몇 시간 동안. 일단은 미리 데워 37 BME 문화 매체의 1.5 ML 2 ML로 MatTek 요리를 기입 °, 부착 C. 해부의 날은 일 공라고도합니다.
- 사람췌장 explant 문화의 ipulation은 층류 후드에 무균 조건 하에서 수행됩니다. 실험 조건이 다른 타이밍을 (화학 약품과 explants의 예 부화) 지시하지 않는 한 BME 문화 매체는 매일 변경됩니다. explants 한 일주일 5 일 동안이 조건에서 배양 할 수 있습니다.
4. 췌장 Explants에 대한 전체 마운트 Immunofluorescence 얼룩 프로토콜
immunofluorescence 프로토콜의 모든 단계 (고정에서 영상까지) 플라스틱 바닥 요리보다 이미지를 얻을 동일한 MatTek 요리에서 수행됩니다. 고정 후, 췌장 explant 문화는 무균 조건 하에서 보관 할 필요가 없습니다.
- BME 문화 매체를 대기음 2 ML 1X PBS로 한 번 explant을 씻는다.
- explant 고정 2 ML 얼음처럼 차가운 4 % paraformaldehyde (PFA)와 PBS를 교체하고 20 분에 얼음 접시를 놓습니다. 로 시간의 판 부드럽게 소용돌이시간,하지만 explant가 분리 하듯이, 흔들 플랫폼을하지 마십시오.
- PFA를 제거하고 실내 온도 (RT)에서 10 분 각각에 대한 1X PBS 2 ML과 explant 세 번 씻는다.
- 2 ML 차단 솔루션 블록 (1X PBS + 0.1 % 트리톤 - X + 3 % 돈키 세럼) RT 적어도 30 분에.
- 솔루션을 차단에 차 항체를 희석와 4에서 하룻밤 배양을위한 전체 explant 표면 ° C.를 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 직접 희석의 150 μl를 추가합니다 물리적 움직임을 최소화 직접 추운 방 (4 ° C)의 explants에 차 항체를 추가 할 수 있습니다. 증발을 방지하기 위해 항체를 추가하기 전에, 습기 챔버에 MatTek 판을 놓습니다.
- 그 다음 날은 항체 솔루션을 제거 2 ML 1X PBS로 세 번 씻어 + 0.1 % 십대 초반-20 RT 30 분 각각에 대해 (PBT).
- 솔루션을 차단에 차 항체를 희석 [제조업체의 권장 사항에 따라, 우리는 당나귀 알렉사 형석 염료에게 보조 백신을 사용1:750 희석]와 어둠 속에서 RT에서 1-2 시간의 배양을 위해 전체 explant 표면을 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell로 직접 희석의 150 μl를 추가로 기관. 핵 counterstaining를 들어, 차 항체 희석과 함께 Hoechst가 포함되어 있습니다. 증발을 방지하기 위해 항체를 추가하기 전에, 습기 챔버에 MatTek 판을 놓습니다.
- 2 ML 1X PBS로 세 번 씻어 + 0.1 % 30 분 RT에서 각 십대 초반 - 20 (PBT).
- 설치하기 전에, 십대 초반-20을 제거 1X PBS로 한 번 씻는다. MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 수성 장착 매체 중 하나 드롭 (안티 - 변색이있는)를 추가하여 장착합니다. 부드럽게, 유리 coverslip으로 explant을 다룹니다. 공기 거품을 피하십시오.
- MatTek 판에 Explants는 실험의 목적에 따라 표준 위상 대비 현미경 또는 공 촛점 현미경 아래에서 볼 수 있습니다. 공 촛점 현미경 분석에 우리는 Zeiss의 LSM 700 역 설정을 사용합니다. 우리 fluorophores에 적합한 레이저를 설정거구나. 목표를 선택하는 것 이미지 췌장 explant의 원하는 영역을. 10X 물 침지 목표는보기의 분야에서 전체 explant를 유지하는 데 적합합니다. 40X 물 또는 기름 침지 목표는 더 큰 해상도를 가진 췌장 explant의 특정 지역에 초점을하기 적합합니다. explants 광학 sectioned 후 취득 Z-스택이 적절한 소프트웨어를 사용하여 3D로 복원 할 수 있습니다.
5. 췌장 Explants의 라이브 셀 이미징 프로토콜
- 환경 챔버 설정 : 환경 인클로저와 작은 배양 챔버를 사용하는 현미경 무대에 앉아 [온도와 CO 2 제어]. 배아 췌장의 적절한 배양은 37 ° C와 humidified 5 % CO 2의 제어 분위기의 안정적인 온도를 필요로합니다. 적합 방은 여러 공급 업체에서 제공하는 (예를 들어, Zeiss, 니콘, 올림푸스). 히터 상자를 조립하고 전원을 켭니다이미징 전에 t 이상 1 시간은 장비가 몸을 따뜻하게하고 5 % CO 2 컨텐츠를 평형 할 수 있도록 시작합니다.
- 췌장 explant 문화의 시간 경과 영상의 경우, 우리는 Zeiss의 LSM 700 역 현미경을 사용합니다. 레이저 및 목표 선택에 대한 포인트 4.10을 참조하십시오.
- 췌장 explant의 라이브 영상을 시작하기 전에 잘 유리 바닥 요리에 연결 봅시다. [우리는 일반적으로 라이브 영상은 1 일부터 수행].
층류 흐름 후드에서 대기음 및 최적의 영양 조건을 시작하는 신선한 BME 문화 매체로 explant 매체를 교체하십시오. - 부드럽게 현미경 방으로 explants를 전송하고 공 촛점 현미경의 표본 홀더에 배양 챔버에 MatTek 요리를 놓습니다.
- 목표를 준비 (예 : 집중 목적의 선택에 따라 기름이나 물 매체를 추가)과 explant에 대한 관심의 지역에 초점을 맞 춥니 다. 환경 챔버를 제대로 닫습니다. 시간이 경과하는 동안 증발을 방지하려면물 대신에 물 침지 목표로 인수는, 그것은 (예 : Zeiss Immersol W) 상업적으로 사용할 수 있습니다 점성 집중 유체를 사용하는 것이 좋습니다.
- 레이저 강도, Z-스택 인수 매개 변수와 시간 간격을 (문제 해결에도 토론 참조) 설정합니다. 실험을 시작합니다.
- 이미징, 수출 Z 스택 및 모든 시간 지점 이후 해당 소프트웨어를 (예 : ImageJ, Volocity, Imaris, 호이겐스)를 사용하여이를 분석 할 수 있습니다.
6. 대표 결과
등쪽 췌장 꽃 봉오리는 (함께 주변 mesenchyme 포함) E11.5 및 E12.5 직접 유리 바닥 문화 요리 (그림 1)에 도금 사이의 마우스 배아 분석하던되었습니다. 혈관은 상피를 둘러싼 mesenchyme에 존재하며 내피 마커 Pecam 12 (데이터가 표시되지 않음)에 대해 immunostaining으로 시각화 할 수 있습니다. 문화, 췌장 explants 숙녀의 두 일 후에상당한 성장을 erwent과 그의 핵 췌장 전사 인자에 양성 반응했다 분지 상피 구조, Pdx1 (그림 2A-C)로 자신을 구성하기 시작했다. 문화의 일 3 췌장 explants의 평균 Z-두께는 60-80 μm이다. explants의 표면과 볼륨이 적절한 소프트웨어 (예 : 호이겐스)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 형태론과 immunofluorescence 분석은 췌장 explants는 생체 초기 췌장 차별화 및 morphogenetic 이벤트 5,10,11,14 (그림 2)에 recapitulated이 프로토콜을 사용하여 배양 것으로 나타났다. 문화의 일 4 췌장 explants은 전형적인 '팁과 트렁크 "cpa1를 표시 상피 8 분리, + 트렁크 내부 클러스터로 구성된 상피 가지 (그림 2C)와 차별화 된 인슐린 +과 글루카곤 + 세포의 끝 전구 세포 (그림 2D를 받았습니다 ). 또한, pancreati예 생체 문화의 C 상피는 기저 멤브레인 (빨간색 그림 2E)의 꼭대기 F-고를의 국산화 (그림 2E, 녹색) 및 B1-인테그린과 적절한 세포 골격의 조직과 세포 극성을 보여 주었다.
(; 마우스 스트레인 잭슨 연구소의 이용이 가능합니다 MT / MG) (그림 3) 실시간으로 분기 췌장 공부를하기 위해 태아의 췌장 explants는 이중 색 형광 기자 마우스 변형 membrane-Tomato/membrane-Green 15 일부터 고립되었다. 아직도 문화에 성장 MT / MG 췌장 explants의 시간 경과 영화의 프레임은 그림 3에 표시됩니다. 막 구조에 산 형광 단백질의 지방화는 세포 형태를 설명하고 시간이 지남에 따라 세포 리모델링 및 마이그레이션을 추적 할 수 있도록, 고급 세포 프로세스의 해상도를 할 수 있습니다.
12 시간 시간 경과 실험 후 산 형광 신호는 가능한 및 dete 남아ctable, 그 강도가 가장 가능성이 photodamage로 인해 (그림 3), 감소에도 마찬가지입니다. photodamage 및 광독성을 피하거나 줄일 수있는 기술 솔루션은 토론 섹션에 설명되어 있습니다.
그림 1. E12.5 마우스의 배아에서 등쪽 췌장의 꽃 봉오리의 해부의 개략도. E12.5 마우스 배아의 (A) Brightfield 이미지입니다. 배 (간 위)과 꼬리 지역의 상반신은 중간 바디 (B)를 분리 제거됩니다. 절개은 빨간색 점선으로 표시됩니다. 위와 십이지장 지역의 노출 (점선 상자로 표시)에서 (C) 또한 분해 결과입니다. 등쪽 췌장 버드 (빨간색 점선 원을 참조) 위와 비장의 primordium 옆에의 기지에 위치해 있습니다. 해부 등쪽의 췌장 꽃 봉오리 (D)는 BME 배양액을 포함하는 유리 바닥 요리의 microwell (E에 파스퇴르 피펫으로 전송됩니다, F). 약어 : 스토 (위), SP (비장), DP (등쪽 췌장 꽃 봉오리), 듀오 (십이지장). 스케일 바, 1000 μm (A, C).
그림 2. 췌장 explant 문화의 전체 마운트 공 촛점 immunofluorescence 분석. 일 1 예 생체 문화의 일 2 췌장 explants의 (A) Brightfield 이미지. 레드 점선은 상피의 분기의 개시를 나타냅니다. 전체 마운트의 (B) 3D 재건은 3 일 췌장 문화 Pdx1에 immunostaining. 췌장 explants는 문화의 48 시간으로 다양한 분기를 겪고 Pdx1 + 세포의 tubules을 보여 주었다. basolateral 막 마커 E-cadherin (Ecad), 팁 전구 마커, Carboxypeptidase 1 (Cpa1)와 phospho-히스톤 H3 (pHH3)에 대한 항체가있는 3 일 췌장 explant의 (C) 전체 마운트 immunostaining. 활성 mitotic pHH3 + 세포의 대부분은 Cpa1 + 세포와 주변 팁에 colocalize. 점선 리터아이 네스는 가지의 팁을 나타냅니다. 내분비 계보 (Lineage) 마커, 인슐린 (기능) 및 일 3 글루카곤 (Gluca)을 (D) 전체 마운트 immunostaining. 노란색 화살표는 기능의 클러스터 +와 Gluca + 셀을 나타냅니다. 삽입 (D '), 내분비 세포 클러스터의 하나의 높은 배율. Pdx1, β1 인테그린 (β1int)와 F-고를 (사실)에 대한 3 일 췌장 explant의 (E) 전체 마운트 immunostaining. Pdx1 양성 상피 세포들 사이 사이 중간 엽 세포 (별표). C, D 및 E에 표시되는 이미지는 Z-시리즈 단일 공 촛점 광학 섹션입니다. 스케일 바, 100 μm (A, B), 50 μm (CE).
그림 3. 예를 생체 교양 췌장 explant 대표 라이브 셀 이미징. MT / MG 마우스 유전자 변형의 배아에서 췌장 explant의 시간 경과 영화에서 (AD) 프레임. 분 영상의 시간은 시간에 표시됩니다. explant는 1 일부터 시작 이미징되었다. Z-스택 이미지40X 기름 침지 목표 15 시간의 총 매 12 분을 인수했다. 점선은 상피와 mesenchyme 사이의 지점과 국경의 팁을 나타냅니다. 규모 바, 50 μm.
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토론
췌장의 운명이 지정되면, 췌장 전구 세포는 결국 성숙하고 기능 오르간 2,4를 형성하기 위해 광범위한 확산, 차별화 및 morphogenesis을 받고있다. 현재 분기하는 방법은 췌장에서 일어난 방법은 전구 증식과 분화에 연결되어 대부분 알 수 있습니다. 췌장 explant 문화는 이러한 프로세스에게 예 생체 5,9,11을 명료하게하다 할 수있는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 초기 췌장 꽃 봉오리의 전 생체의 explants과 라이브 셀 이미징을 결합하여 하나는 배아의 췌장의 morphogenesis 동안 개최 이벤트의 명확한 그림을 얻을 수 있습니다. 이 비디오 문서는 전체 마운트 immunofluorescence 및 라이브 이미지에 이상적 만드는 유리 지원에 배아 췌장의 전 생체 문화를 확립하는 간단한 방법을 제공합니다.
이미징 C에 대한 예 생체의 췌장 explants...
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공개 사항
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감사의 글
연구 Spagnoli 실험실. Helmholtz 협회, FP7-IRG-2008-ENDOPANC 교부금 및 ERC-2009-시작 HEPATOPANCREATIC 교부금으로 운용되고 있습니다.
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재료
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 항체 : Carboxypeptidase E-cadherin F-고를 글루카곤 인슐린 β1-인테그린 Pdx1 Pdx1 Phospho-히스톤 H3 | 아브드 Serotec Invitrogen 분자 프로브 ImmunoStar Millipore Millipore Abcam 하이 브리 도마 은행 셀 Signalling | 1810-0006 13-1900 A-12373 20,076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| 기저 매체 독수리 (BME) | 시그마 | B1522-500ML | 멸균 조건에 보관 |
| 세포 배양 등급 물 | PAA | S15-012 | 멸균 조건에 보관 |
| 문화 요리 (유리 바닥), 35-mm | MatTek 공사 | P35G-0-20-C | |
| 당나귀 세럼 | Chemicon | S30-100 ML | |
| 태아 송아지 혈청 골드 | PAA | A15-151 | 멸균 조건에 보관 |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | 주식 솔. 세포 배양 등급 물 1 MG / ML |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | 멸균 조건에 보관 |
| 글루타민 | Invitrogen | 25030-024 | 멸균 조건에 보관 |
| 4 잘 Multidishes | Nunc | 176740 | |
| 현미경 : 역 공 촛점 현미경 (LSM 700) Stereomicroscope (디스커버리 V12) | Zeiss Zeiss | 목표 : C-고차 색지움 0.45 / 10X W M27 (work. 지구 1.8 mm,. 이미징 깊이 ~ 100 ㎜), C-고차 색지움 1.2 W Corr M27 (work. 지구 0.28 mm., ~ 영상 깊이 50 μm) / 40X 위에서 아래에서 광섬유 조명의 Transillumination | |
| Paraformaldehyde | 로스 | 0335.3 | 증권 솔루션 20% |
| 파스퇴르 Pipet (유리), 150mm | VWR | HECH567 / 1 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | PAA | P11-010 | 멸균 C에 보관onditions |
| 배양 접시, 60mm | Greiner 바이오 하나 | 628102 | |
| 배양 접시, 35mm | Greiner 바이오 하나 | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | 멸균 조건에 보관 |
| 봄 가위 8mm 블레이드가 휘어 | 정밀 과학 도구 | 15023-10 | |
| 트리톤 - X100 | 로스 | 3051.3 | |
| 시계 제조 인의 foreceps 뒤몽 # 5 | 로스 | K342.1 |
참고문헌
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