대량 병렬 DNA 시퀀싱 기술을 기반으로 한 게놈 어셈블리는 대개 매우 단편화되어 있습니다. 물리적 염색체 지도의 개발은 게놈 어셈블리를 잠재적으로 개선할 수 있습니다. 본 연구에서는 물리적 지도 제작의 처리량을 크게 높일 수 있는 염색체 준비, 형광 in situ 하이브리드화 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 제시합니다.
이 논문에서
요약
초록
10,000종의 척추동물1 및 5,000종의 곤충 및 관련 절지동물2에 대한 전장 유전체 서열을 확보하려는 프로젝트가 향후 5년에 걸쳐 진행될 예정입니다. 예를 들어, 15종의 말라리아 매개 모기 유전체 시퀀싱이 현재 Illumina 플랫폼을 통해 수행되고 있습니다3,4. 이 Anopheles 종 군집에는 말라리아 매개체와 비매개체가 모두 포함되어 있습니다. 유전체 조립 결과가 가용해지면, 연구자들은 매개 능력과 관련된 진화적 변화를 추론하기 위한 비교 분석을 수행할 수 있는 독특한 기회를 갖게 될 것입니다. 하지만 차세대 시퀀싱 리드를 사용하여 고품질의 de novo 유전체 조립을 생성하는 것은 어려운 것으로 밝혀졌습니다5. 또한, Sanger 방법으로 얻은 Anopheles gambiae의 기존 유전체 조립물은 갭이 존재하거나 단편화되어 있습니다4,6.
연구자가 염색체 기반의 게놈 어셈블리가 아닌 수많은 시퀀싱 컨티그(contig)를 다루게 되면 비교 게놈 분석의 성공 가능성은 제한될 것입니다. 단편화되고 매핑되지 않은 서열은 다음과 같은 이유로 게놈 분석에 문제를 일으킵니다: (i) 확인되지 않은 갭으로 인해 게놈 서열의 주석(annotation)이 부정확하거나 불완전해지며, (ii) 매핑되지 않은 서열은 파라로그(paralogous) 유전자와 서로 다른 하플로타입(haplotype) 유전자 사이의 혼동을 야기하고, (iii) 시퀀싱 컨티그의 염색체 할당 및 방향성이 결여되어 재배열 계통학을 재구성하거나 염색체 진화를 연구하는 것이 불가능해지기 때문입니다. 새로 시퀀싱된 게놈을 가진 종에 대해 고해상도 물리 지도를 구축하는 것은 게놈 주석, 진화 분석 및 자연 집단 내 개별 게놈의 재시퀀싱을 용이하게 하는 시의적절하고 비용 효율적인 투자입니다7,8.
여기서 우리는 염색체 표본 제작과 형광의 혁신적인 접근 방법을 제시합니다. 인 시투(in situ) 하이브리드 형성(FISH) 및 물리적 지도의 신속한 개발을 돕는 이미징. 다음을 사용하여 An. gambiae 예를 들어, 저희는 물리적 염색체 지도를 구축함으로써 게놈 조립을 잠재적으로 개선할 수 있으며, 결과적으로 게놈 분석의 품질을 높일 수 있음을 보여줍니다. 우선, 고압법을 사용하여 다사 염색체 도말 표본을 준비합니다. 본래 ~을 위해 개발된 이 방법은 초파리9, 일반적인 압착법보다 염색체의 더 자세한 세부 사항을 시각화할 수 있게 해줍니다.10둘째, 고처리량 물리적 게놈 매핑을 위해 완전히 자동화된 FISH 전단(front-end) 시스템이 사용됩니다. 이 자동 슬라이드 염색 시스템은 여러 분석을 동시에 수행하여 수작업 시간을 획기적으로 단축합니다.11셋째, 전동 슬라이드 스테이지가 포함된 자동 형광 이미징 시스템을 사용하여 FISH 이후 표지된 염색체를 자동으로 스캔하고 촬영합니다.12이 시스템은 동일한 슬라이드 상에서 여러 개의 염색체 판을 식별하고 시각화하는 데 특히 유용합니다. 또한, 스캐닝 과정을 통해 더욱 균일한 FISH 결과를 얻을 수 있습니다. 전반적으로, 자동화된 고처리량 물리적 매핑 프로토콜은 표준 수동 프로토콜보다 더 효율적입니다.
프로토콜
1. 난소 간세포를 이용한 고압 폴리텐 염색체 제작
- 흡혈 25시간 후의 반-임신 상태인 Anopheles 암컷을 해부 현미경 하에서 해부하고, 메탄올이 포함된 신선한 modified Carnoy's solution(100% methanol: glacial acetic acid, 3:1)으로 난소를 고정한다. 이 단계에서 난소는 난포가 타원형이고 난포 내의 영양세포가 포함된 투명 영역이 둥근 모양을 띠는 Christophers' III 발달 단계에 해당한다13. 약 5마리의 암컷에서 추출한 난소를 1.5 ml Eppendorf tube에 담긴 500 μl의 modified Carnoy's solution에 넣고 실온에서 24시간 동안 보관한다. 장기 보관을 위해 난소를 -20 °C로 옮긴다.
- 슬라이드 제작 직전에 에탄올(100% ethanol: glacial acetic acid, 3:1)과 50% propionic acid를 사용하여 modified Carnoy's solution을 준비한다. 먼지가 없는 슬라이드 위에 modified Carnoy's solution 한 방울을 떨어뜨리고 난소 한 쌍을 올린다. 해부용 바늘을 사용하여 난소를 약 6개 구역으로 분할하고, MZ6 Leica 실체 현미경 하에서 깨끗한 슬라이드 위의 50% propionic acid 방울 속에 배치한다. 각 구역마다 별도의 슬라이드를 사용한다.
- 바늘을 사용하여 난포를 분리하고, 해부 현미경 하에서 거름종이나 페이퍼 타월로 남은 조직을 닦아낸다. 난포에 50% propionic acid 한 방울을 새로 추가하고 실온에서 3-5분 동안 방치한다. 50% propionic acid 방울 위에 커버슬립을 덮는다. 슬라이드를 약 1분 동안 그대로 둔다.
- 슬라이드를 거름종이와 플라스틱으로 감싼다. Flex-Shaft 부착물과 부드러운 플라스틱 팁이 장착되고 3000-5000 RPM으로 설정된 Dremel 200 로터리 툴을 사용하여, 팁을 원형으로 돌리며 커버슬립을 가볍게 눌러 핵이 균일하게 퍼지도록 난포를 압착한다. 이 단계는 약 1분 정도 소요된다. Olympus CX41 위상차 현미경의 20x 대물렌즈를 사용하여 도말 품질을 확인한다.
- 염색체가 덮인 커버슬립 옆에 추가 커버슬립을 배치하고, 그 위를 두 번째 현미경 슬라이드로 덮어 샌드위치 구조를 만든다. 이는 바이스(vise)로 슬라이드를 누를 때 파손될 가능성을 줄이기 위함이다. 샌드위치 구조를 고정하고 바이스로 인한 슬라이드 긁힘을 방지하기 위해, 유리 슬라이드 보관함에 들어있는 플라스틱 시트와 거름종이로 슬라이드를 감싼다.
- 기계식 바이스를 통해 슬라이드에 압력을 가한다. 토크 렌치를 사용하여 85-120 inch-lbs의 압력을 가하는 것으로 충분하다. 이 단계는 염색체를 최대한 평평하게 펴기 위해 필요하다.
- 두 번째 현미경 슬라이드와 추가 커버슬립을 제거한다. 염색체가 덮인 커버슬립 슬라이드를 슬라이드 변성/하이브리드 시스템에서 55 °C로 10-15분 동안 가열하여 염색체를 더욱 평평하게 펴준다. 슬라이드를 액체 질소에 최소 15초 동안 담그고, 기포 발생이 멈추면 면도날을 사용하여 빠르게 커버슬립을 제거한다. 즉시 슬라이드를 차가운 50% ethanol에 5분 동안 담근다. 70%, 90%, 100% ethanol에서 각각 5분 동안 슬라이드를 탈수시킨다. 슬라이드를 공기 중에서 건조한다.
2. 자동 슬라이드 염색 시스템을 이용한 FISH
프로브 표지를 제외한 다음 단계들을 수행하도록 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템에 프로그램이 설정되었습니다. 세부적인 닉 번역 표지 프로토콜은 Fermentas의 DNA polymerase와 함께 제공된 문서에 설명되어 있습니다.
- FISH 수행 전, 닉 번역(nick-translation) 프로토콜을 사용하여 게놈 BAC DNA를 형광색소로 표지하여 형광 프로브를 준비한다. DNA 1 μg, 표지되지 않은 dATP, dCTP, dGTP 각각 0.05 mM 및 dTTP 0.015 mM, Cy3- 또는 Cy5-dUTP 1 μl, BSA 0.05 mg/ml, 10x 닉 번역 버퍼 5 μl, DNA polymerase I 20 units, DNase I 0.0012 units, 그리고 nuclease-free water를 혼합하여 최종 부피를 25 μl로 맞춘다. DNA polymerase I/DNase I 비율은 300에서 500 bp 범위의 크기를 가진 프로브를 얻기 위해 경험적으로 선택한다. 혼합물을 15 °C에서 1시간 동안 배양한다.
- 슬라이드와 시약을 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템에 넣고 다음 단계들을 실행하는 프로그램을 시작한다. 1x PBS 800 μl를 20분 동안 처리한다. 공기로 슬라이드를 불어 건조한다. 1x PBS에 희석된 4% 포르말린 450 μl를 1분 동안 처리하여 포르말린 고정을 수행한 후, 100% 에탄올로 1초씩 2회, 2분 동안 1회 세척한다. 공기로 슬라이드를 불어 건조한다.
- 프로브 처리 시 기포 발생을 방지하기 위해 슬라이드를 45 °C에서 2분 동안 가열한다. DNA 프로브 20 μl를 처리하고, 하이브리드화 용액의 증발을 막기 위해 미네랄 오일을 몇 방울 첨가한 뒤 커버슬립을 덮는다. 슬라이드를 90 °C에서 10분 동안 가열하여 염색체와 DNA 프로브를 변성시킨다.
- 하이브리드화를 위해 커버슬립을 덮은 상태로 슬라이드를 42 °C에서 14시간 동안 배양한다. 하이브리드화 용액은 2x SSC, 100 mM 인산나트륨, 1x Denhardt's 용액, 100 μg/ml 아자이드화 나트륨, 그리고 포름아미드 내 10% 덱스트란 황산염으로 구성된다.
- 엄격도 세척(stringency washes)을 위해 슬라이드를 42 °C에서 2분 동안 가열하고 커버슬립을 제거한 후, 2x SSC에서 1초씩 4회 세척한다. 공기로 슬라이드를 불어 건조한다. 42 °C의 0.4x SSC 800 μl를 10분 동안 2회 처리한다. 25 °C의 2x SSC에서 슬라이드를 10분 동안 세척한다.
- 1x PBS에 희석된 1 μM YOYO-1 50 μl를 처리하여 염색체 염색을 수행한다. 염색액의 증발을 막기 위해 미네랄 오일을 몇 방울 첨가하고 커버슬립을 덮은 뒤 25 °C에서 10분 동안 배양한다. 커버슬립을 제거하고 2x SSC에서 1초씩 4회 슬라이드를 세척한다. 공기로 슬라이드를 불어 건조한다. ProLong Gold 안티페이드 시약 15 μl를 처리하고 커버슬립을 덮는다.
3. 자동 형광 이미징 시스템을 이용한 슬라이드 판독
이 섹션에서는 ACCORD PLUS 자동 스캐닝 시스템에 기본으로 제공되는 Duet 소프트웨어의 사용법에 대해 자세히 설명합니다. 지침은 다음 순서로 전원을 켠 후 시작합니다: 할로겐 램프용 Olympus U-RFL-T 전원 공급 장치, Dell precision T3500 컴퓨터, Olympus U-CMAD3 카메라가 연결된 Olympus BX61 현미경.
- 10x Pre-Scan을 설정하려면 ACCORD PLUS 자동 스캐닝 시스템에서 Duet 소프트웨어를 엽니다. "Online" 버튼을 클릭합니다. 새로운 Case ID를 입력하고 Slide ID를 할당합니다. "BF"라고 표시된 점을 클릭합니다. 이는 명시야(brightfield) 옵션입니다. 스캔 선택 항목을 "10x Prescan"으로 설정합니다. "2500x circle", "10000x circle" 또는 "rectangle"을 사용합니다. 10x Pre-Scan을 위해 "Set&run"을 클릭합니다.
- "OK" 버튼을 클릭하여 10x Pre-Scan을 실행합니다. 안내 메시지에 따라 스캐닝을 적절하게 조정합니다. "Finish"를 클릭하여 스캔을 시작합니다. "Main" 탭을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다. "Offline" 버튼을 클릭합니다. 할당된 Case ID와 Slide ID를 찾아 "Offline Scan"을 클릭합니다. 왼쪽 상단 영역의 검은색 상자에서 화살표를 클릭하고 "10x Prescan"을 선택합니다. 화살표(< || Δ >, 즉 "back", "pause", "play", "forward" 버튼)를 사용하여 스캔된 이미지들을 살펴봅니다.
- 관심 있는 이미지를 찾으면, 화면의 대상 영역 중앙을 더블 클릭하고 "Snap"을 누릅니다. 이렇게 하면 나중에 캡처할 이미지 대상이 지정됩니다. 모든 대상을 선택한 후 "Classify"를 클릭합니다. "10x Prescan"을 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지를 분류합니다. "Polytene"을 선택합니다.
- Duet 소프트웨어에서 40x Pre-Scan을 설정합니다. "Main"을 클릭하여 메인 메뉴로 돌아갑니다. 다시 "Online"을 선택합니다. 슬라이드를 선택합니다. "BF"를 "FL"로 변경합니다. 작업 이름을 "Revisit-X40-RG"로 변경합니다. 마지막 설정 바로 아래의 섹션을 "Revisit-ALL"로 변경합니다. "Set&Run"을 클릭합니다. "OK"를 누릅니다. 안내 메시지에 따라 다시 자동화 설정을 진행합니다. "Start matching views" 버튼을 클릭하여 10x 이미지와 40x 이미지를 일치시킵니다. "Finish"를 클릭하여 스캔을 시작합니다. 완료되면 "Classify"를 클릭하여 이미지들을 확인합니다.
4. 대표 결과
그림 1은 고압 염색체 표본 제작 과정을 도식적으로 나타낸 것입니다. 이 단계에는 Dremel 공구와 기계식 바이스를 사용하여 염색체를 압착 및 평탄화하는 과정과 위상차 현미경을 이용한 염색체 시각화 과정이 포함됩니다. 그림 2는 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 염색체 슬라이드 표본 상의 표적 DNA에 형광 표지 프로브를 하이브리드화하는 과정, FISH 실험 후 프로브를 시각화하고 매핑하기 위한 자동 스캐닝 현미경의 사용, 그리고 염색체 상에 게놈 스캐폴드를 배치하고 방향을 설정하는 과정을 보여줍니다.
An. gambiae 암컷의 난소 영양세포 다가염색체 표본은 고압법을 사용하여 제작되었습니다. 이 방법은 대부분의 염색체 구조를 손상시키거나 변형시키지 않습니다(그림 3). 또한, 굽어 있는 염색체를 펴줌으로써 일반적인 표본 제작법으로는 보이지 않는 숨겨진 미세 띠들을 드러나게 합니다(그림 4).
본 프로토콜에서 사용된 프로브는 An. gambiae PEST 균주 DNA로부터 생성된 ND-TAM BAC 라이브러리에서 얻은 게놈 BAC DNA 클론입니다. 이 라이브러리를 위한 게놈 DNA는 암수 모두의 갓 부화한 1령 유충에서 추출되었습니다. 그림 5는 An. gambiae의 다사 염색체에 하이브리드화된 BAC 클론을 이용한 FISH 결과입니다. 이 절차는 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 수행되었습니다. An. gambiae의 세포유전학적 광학지도10를 사용하여, 두 개의 BAC 클론인 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694)와 BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698)가 각각 2R 암의 16C 및 16D 구역에 위치함을 확인했습니다. 그러나 An. gambiae PEST 균주 AgamP3 어셈블리14를 대상으로 BLAST 검색을 수행한 결과, 102B24 및 142O19와 상동인 서열이 각각 2R 암의 16B 및 17A 구역에서 확인되었습니다 (표 1). 따라서 게놈 좌표와 세포유전학적 구역 사이의 대응 관계를 이제 우리의 매핑 데이터에 따라 조정할 수 있습니다. An. gambiae M형 및 S형 게놈 어셈블리를 대상으로 한 BLAST 검색 결과, 두 BAC 클론이 서로 다른 컨티그(contig)에 위치하지만, 각 형태 내의 동일한 스캐폴드(scaffold)에 위치하는 것으로 나타났습니다 (표 1). 이제 확인된 컨티그들을 특정 염색체 위치와 연관 지을 수 있습니다. 또한, 확인된 스캐폴드들을 세포학적 구역 16CD 내에서 적절하게 정렬할 수 있습니다. 흥미롭게도, 스캐폴드 내 102B24와 142O19 서열 사이의 거리는 PEST 균주, M-형, S-형 게놈 어셈블리에서 각각 1,892,981 bp, 1,658,391 bp, 1,688,426 bp였습니다. PEST 균주는 M형과 S형의 잡종이므로, 이러한 차이는 PEST 게놈의 잘못된 어셈블리로 인한 것일 가능성이 높습니다.
| BAC (등록번호) | PEST-균주 AgamP3 좌표 | M-형 컨티그(contigs) 좌표 | M-형 스캐폴드(scaffolds) 좌표 | S-형 컨티그(contigs) 좌표 | S-형 스캐폴드(scaffolds) 좌표 |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874 | ABKP020247 53.1 32,513- 33,045 | EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909 | ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832 | EQ099711.1 215,891- 216,424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969 | ABKP020247 51.1 24,816- 25,575 | EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442 | ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540 | EQ099711.1, 305,514- 306,272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264 | ABKP020247 01.1 2,499- 3,185 | EQ090167.1 315,806- 316,492 | ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942 | EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323 | ABKP020220 17.1 30,971- 32,469 | EQ090167.1 200,518- 202,016 | ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508 | EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317 |
표 1. An. gambiae의 게놈 어셈블리에 대한 BAC-end 서열의 BLAST 결과.
그림 1. 고압 염색체 표본 제작의 모식도. 적절한 발달 단계의 모기 난소가 표시되어 있다.
그림 2. 자동화된 FISH, 슬라이드 스캐닝 및 게놈 스캐폴드의 염색체 매핑을 나타내는 모식도.
그림 3. 고압법을 사용하여 얻은 An. gambiae의 다사염색체 3번의 도말 표본. 3L과 3R은 각각 말단부의 좌측 및 우측 암(arm)을 나타낸다. PH와 IH는 각각 중심절 주변 이질염색질과 간질 이질염색질을 나타낸다.
그림 4. 전통적인 방식(위)과 고압 방식(아래)으로 제작한 An. gambiae 의 다가 염색체 비교. 이미지는 3R 암(arm)의 29A-30E 구역(A)과 3L 암의 43D-46D 구역(B)을 보여준다.
그림 5. An. gambiae의 다사 염색체에 대한 BAC 클론의 FISH 분석. A) 2R 암(arm)과 102B24(적색 신호)의 하이브리다이제이션. B) 신장된 2R 암의 16C 및 16D 구역에 각각 수행한 102B24(적색 신호)와 142O19(청색 신호)의 이중 색상 FISH. 화살표는 Cy3(적색) 및 Cy5(청색)로 표지된 BAC 클론의 하이브리다이제이션 신호를 나타냄. C-중심절 부위. a/+는 이형접합 2La 역위를 나타냄. 염색체는 형광물질 YOYO-1로 대조 염색됨.
토론
고압법의 가장 중요한 단계는 난소 발달의 Christophers' III 단계13에서 분리한 난소 영양세포를 적절하게 압착(squashing)하는 것입니다. 압착이 부적절하면 염색체가 충분히 퍼지지 않아 FISH 이후 프로브 위치를 결정할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 반대로 염색체가 과하게 압착되면, 염색체가 파손되거나 밴딩 패턴을 알아볼 수 없을 정도로 늘어날 수 있습니다. 여러 장의 슬라이드를 제작하다 보면 Dremel 도구를 사용한 슬라이드 압착 과정에 일관성이 생기며, 이는 전반적인 슬라이드 제작 효율을 높여줍니다. 고압 기술은 원래 갓 분리한 D. melanogaster의 침샘을 위해 처음 개발되었습니다9. 하지만 모기의 난소는 염색체 표본 제작에 사용되기 전, 일반적으로 변형된 Carnoy 고정액(메탄올: 빙초산 = 3:1 부피비)에 보존됩니다. 따라서 본 연구에서는 기존의 고압 프로토콜을 수정하여 말라리아 모기인 An. gambiae의 고정된 난소 영양세포 다가염색체에 적합하도록 만들었습니다. 정밀 바이스를 사용하여 슬라이드 전체 면에 매우 평행한 작업 표면으로 고압을 가하므로, 연필 지우개를 이용한 전통적인 태핑(tapping) 기법을 사용하는 것보다 염색체 압착 표본을 준비하는 시간이 훨씬 단축됩니다.
다른 중요한 단계로는 모낭을 50% propionic acid에 충분히 담그는 것과 슬라이드를 가열하는 것이 포함됩니다. 이 두 단계는 염색체를 평평하게 펴는 데 필수적입니다. 이를 소홀히 하면 탈수 후 염색체가 반짝거릴 수 있으며, 이는 FISH에서 신호로 오인될 수 있는 과도한 배경 잡음을 유발할 가능성이 있습니다. 고압 압착 기술은 유사 분열 염색체 표본을 제작할 때 동일한 용액을 사용하여 효과적으로 적용할 수 있습니다. 추가적인 확산 및 평탄화 작업은 핵으로부터 염색체를 더 잘 분리하는 데 도움이 됩니다. 균일한 압력을 가하면 염색체가 적절하게 펴져 측정이 가능해지며, 염색으로 보이는 밴드의 해상도가 잠재적으로 향상될 수 있습니다. 모기에서 유사 분열 염색체를 분리하는 세부 사항은 다른 문헌15에 제시되어 있습니다. 일반적인 압착 표본 제작으로도 FISH16 및 면역 염색17을 포함한 많은 목적에 충분하지만, 고압 방법은 슬라이드 간의 잠재적 편차를 줄일 뿐만 아니라 전반적인 염색체 품질을 높여 염색체 매핑 시 더 높은 정밀도를 제공합니다. 이 절차는 레이저 캡처 미세 절단을 위한 다사 염색체 막 슬라이드 제작에도 사용될 수 있습니다.
고압법의 한계점으로는 슬라이드 파손과 염색체의 과도한 신장이 있습니다. 바이스를 통해 슬라이드에 너무 많은 압력을 가하면 슬라이드가 파손될 가능성이 있으나, 본 논문에 명시된 압력을 사용함으로써 이를 제한할 수 있습니다. 염색체의 과도한 신장의 경우, 드레멜(Dremel) 도구를 슬라이드에 너무 오랫동안 적용하면 염색체가 지나치게 늘어나 해상도가 떨어질 가능성이 있습니다. 이는 도구를 짧은 시간 동안만 적용한 후 현미경으로 확인하고, 염색체가 충분히 퍼지지 않았을 경우 드레멜 도구를 추가로 적용함으로써 해결할 수 있습니다.
전통적인 FISH 프로토콜은 여러 번의 세척 및 배양 단계를 포함하며, 각 단계는 보통 5-20분 정도 소요되어 실험 전 과정 동안 연구자의 집중적인 주의가 필요합니다. 또한, 수동으로 처리할 수 있는 슬라이드 수는 일반적으로 한 번의 실험당 몇 장으로 제한됩니다. 반면, 자동 슬라이드 염색 시스템은 모든 단계(세척, 배양, 프로브 도포, 변성, 하이브리다이제이션, 커버슬립 부착 및 제거 포함)를 자동으로 수행합니다. 이를 통해 연구자는 FISH 실험에서 최대 6-8시간의 작업 시간을 절약할 수 있습니다. 더욱이, 자동 FISH 시스템은 처리량을 크게 높일 수 있습니다. 예를 들어, Xmatrx 시스템은 단일 준비 슬라이드에서 최대 40개의 분석을, 듀얼 준비 슬라이드에서는 최대 80개의 분석을 동시에 처리할 수 있습니다. 이 시스템의 제한 사항 중 하나는 다량의 용액을 준비해야 하므로 소규모의 FISH 실험에는 효율적이지 않다는 점입니다. 또한, 시스템에 프로그래밍된 FISH 프로토콜은 새로운 응용 분야에 따라 수정 및 조정이 필요할 수 있습니다.
슬라이드 스캐닝 시스템은 형광 현미경의 자동화 버전입니다. 자동화된 스테이지 이동과 단순한 현미경 제어 패널은 연구자의 시간을 절약해주며 현미경 조작을 매우 간편하게 만들어 줍니다. 예를 들어, ACCORD PLUS 스캐닝 시스템의 소프트웨어를 사용하면 여러 채널의 형광을 쉽게 캡처할 수 있으며 이미지 획득 과정을 효율적으로 관리할 수 있습니다. 그 예로 단일 이미지를 촬영하는 대신 z-stack 캡처 기능을 포함하고 있는데, 소프트웨어가 설정 가능한 z-stack 이미지를 캡처하여 최소한 하나의 이미지는 초점이 맞도록 보장합니다. 이 시스템은 다량의 이미지 획득(단일 슬라이드 내의 많은 세포)에 더 최적화되어 있지만, 슬라이드를 수동으로 탐색하는 것보다 슬라이드 상의 염색체를 찾는 과정을 훨씬 수월하게 해줍니다.
자동 슬라이드 염색 시스템과 스캐닝 시스템은 세포유전학 클리닉에서 인간 세포의 염색체 이상에 대한 FISH 진단에 일상적으로 사용됩니다. 본 연구에서 우리는 이러한 자동화 시스템을 기초 연구 응용 분야에 활용하는 프로토콜을 개발했습니다. 자동화된 고처리량 물리적 매핑 프로토콜은 관심 있는 모든 종에 대한 물리적 염색체 지도의 신속한 개발을 촉진할 수 있습니다. 비록 본 보고서에서는 물리적 매핑을 위해 다사 염색체를 사용했지만, 분열기 염색체 또한 이러한 시스템으로 활용 가능합니다. 대부분의 생물은 판독 가능한 다사 염색체를 형성하지 않으므로, 프로토콜을 분열기 염색체에 맞게 조정하는 것이 유용할 것입니다. 하지만 다사 염색체를 사용할 수 있는 경우, 기능적 게놈 도메인과 염색체 구조 간의 대응 관계에 대해 최고 해상도로 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 밴드 및 인터밴드 패턴과 같은 다사 염색체의 조직 원리는 최근 일반적인 비다사(간기) 염색체의 원리와 유사하다고 비유되었습니다18. 따라서 고압 염색체 표본으로 수행된 상세한 물리적 매핑은 DNA 서열을 밴드, 인터밴드, 퍼프, 중심절, 말단소체 및 이질염색질과 같은 특정 염색체 구조와 연결할 가능성이 있으며, 이를 통해 염색체 기반의 게놈 어셈블리를 구축할 수 있습니다.
공개 사항
선언된 이해상충 없음.
감사의 글
본 연구는 Igor V. Sharakhov에게 제공된 국립보건원(National Institutes of Health)의 연구비 1R21AI094289의 지원을 받아 수행되었습니다. Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템과 ACCORD PLUS 자동 스캐닝 시스템은 Virginia Tech의 Fralin 생명과학연구소, 곤충학과 및 생화학과가 운영하는 장비 신탁 기금(Equipment Trust Fund) 프로그램을 통해 구매되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 22x22 mm 현미경 커버슬립 | Fisher | 12-544-10 | |
| 18x18 mm 현미경 커버슬립 | Fisher | 12-553-402 | |
| 아세트산 | Fisher | A491-212 | |
| 메탄올 | Fisher | A412-4 | |
| 프로피온산 | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Flex-Shaft 부착물이 포함된 Dremel 200 로터리 툴 | Rand | 3" 다목적 미니 벤치 그라인더 (속도 제한기 포함) | |
| Dremel 툴용으로 특별히 설계된 200 μl 플라스틱 팁 (비드형 플라스틱 가장자리) | Pipetman | F171300 | 피펫 팁의 끝부분을 절단하고 가열함 |
| 주석 코팅 래피드 바이스 | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | 0.00025 이내의 정밀 연마된 직각 및 평행도 |
| 토크 렌치 | Craftsman | 44593 | |
| ThermoBrite 슬라이드 변성/교잡 시스템 | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| 25 mm 배리어 슬라이드 | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| 25 mm 커버슬립 | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템 | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| MZ6 Leica 실체 현미경 | Leica | VA-OM-E194-354 | 다른 실체 현미경을 사용할 수 있음 |
| Olympus CX41 위상차 현미경 | Olympus | CX41RF-5 | 다른 위상차 현미경을 사용할 수 있음 |
| ACCORD PLUS 자동 스캐닝 시스템 | BioView (USA) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 10% NBF (중성 완충 포르말린) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 99% 포름아미드 | Fisher Scientific | BP227500 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC 완충액 | Invitrogen | AM9765 | |
| 인산나트륨 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 50x Denhardt 용액 | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| 아지드화나트륨 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| DMSO 내 1 mM YOYO-1 iodide (491/509) 용액 | Invitrogen | Y3601 | |
| ProLong Gold 항퇴색 시약 | Invitrogen | P36930 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| DNA polymerase I | Fermentas | EP0041 | |
| DNase I | Fermentas | EN0521 |
참고문헌
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- Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).
재인쇄 및 허가
