자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑 현장에서 하이브리드화

Summary

대규모 병렬 DNA 염기서열 분석 기술을 기반으로 하는 게놈 어셈블리는 일반적으로 매우 단편화되어 있습니다. 물리적 염색체 지도의 개발은 잠재적으로 게놈 어셈블리를 개선할 수 있습니다. 여기에서는 염색체 준비, 형광 현장 혼성화 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 보여주며 물리적 맵 개발의 처리량을 크게 증가시킵니다.

Abstract

10,000종의 척추동물¹과 5,000종의 곤충 및 관련 절지동물²의 전체 게놈 염기서열을 얻기 위한 프로젝트가 향후 5년 동안 진행될 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 15종의 말라리아 모기에 대한 게놈 염기서열 분석은 현재 Illumina 플랫폼^3,4을 사용하여 수행되고 있습니다. 이 Anopheles 종 클러스터에는 말라리아의 매개체와 비벡터가 모두 포함됩니다. 게놈 어셈블리를 사용할 수 있게 되면 연구자들은 벡터 능력과 관련된 진화적 변화를 추론하기 위한 비교 분석을 수행할 수 있는 독특한 기회를 갖게 됩니다. 그러나 차세대 염기서열분석 판독을 사용하여 고품질의 de novo 게놈 어셈블리를 생성하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다⁵. 더욱이, Anopheles gambiae에 대한 기존 게놈 어셈블리는 Sanger 방법을 사용하여 얻었지만 갭이 있거나 단편화되어 있습니다^4,6.

연구자들이 염색체 기반 게놈 어셈블리가 아닌 수많은 염기서열분석 콘티그를 다루는 경우 비교 게놈 분석의 성공이 제한됩니다. 단편화되고 매핑되지 않은 염기서열은 다음과 같은 이유로 게놈 분석에 문제를 일으킵니다: (i) 확인되지 않은 갭으로 인해 게놈 염기서열에 대한 부정확하거나 불완전한 주석이 발생합니다. (ii) 매핑되지 않은 염기서열은 paralogous 유전자와 다른 일배체형의 유전자 사이의 혼동을 야기합니다. (iii) 염기서열분석 contigs의 염색체 할당 및 방향이 부족하여 재구성, 재배열 계통 발생 및 염색체 진화 연구를 수행할 수 없습니다. 새로 염기서열 분석된 게놈을 가진 종에 대한 고해상도 물리 지도를 개발하는 것은 게놈 주석, 진화 분석 및 자연 개체군에서 개별 게놈의 재시퀀싱을 촉진하는 시의적절하고 비용 효율적인 투자입니다^7,8.

여기에서는 염색체 준비, 형광 제자리 혼성화(FISH) 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 제시하여 물리적 지도의 빠른 개발을 촉진합니다. An. gambiae를 예로 들어 물리적 염색체 지도의 개발이 잠재적으로 게놈 어셈블리를 향상시킬 수 있으므로 게놈 분석의 품질을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 먼저, 고압 방법을 사용하여 polytene 염색체 스프레드를 준비합니다. 원래 초파리⁹를 위해 개발된 이 방법을 사용하면 일반 스쿼시 기법¹⁰보다 염색체에 대한 더 많은 세부 사항을 시각화할 수 있습니다. 둘째, FISH를 위한 완전 자동화된 프론트엔드 시스템이 고처리량 물리 게놈 매핑에 사용됩니다. 자동 슬라이드 염색 시스템은 여러 분석을 동시에 실행하고 수작업 시간을 크게 단축합니다¹¹. 셋째, 전동 슬라이드 스테이지가 포함된 자동 형광 이미징 시스템은 FISH¹² 이후 표지된 염색체를 자동으로 스캔하고 사진을 찍습니다. 이 시스템은 동일한 슬라이드에서 여러 염색체판을 식별하고 시각화하는 데 특히 유용합니다. 또한 스캐닝 프로세스는 보다 균일한 FISH 결과를 캡처합니다. 전반적으로 자동화된 고처리량 물리적 매핑 프로토콜은 표준 수동 프로토콜보다 더 효율적입니다.

Protocol

1. 난소 간호사 세포의 고압 Polytene 염색체 준비

1. 해부 현미경으로 혈액 수유 후 25시간에 반중량 Anopheles 암컷을 해부하고 메탄올(100% 메탄올: 빙초산, 3:1)로 새로 변형된 Carnoy 용액에 난소를 고정합니다. 이 단계에서 난소는 크리스토퍼스의 발달 III단계에 있으며, 이때 난포는 타원형을 띠고, 난포 내의 수유 세포가 있는 투명한 영역은 둥근 모양이다¹³. 약 5명의 암컷의 난소를 1.5 ml Eppendorf 튜브에 담긴 500 μl의 변형된 Carnoy 용액에 넣고 24시간 동안 실온에 보관합니다. 장기 보관을 위해 난소를 -20°C로 옮깁니다.
2. 슬라이드를 만들기 직전에 에탄올(100% 에탄올: 빙초산, 3:1)과 50% 프로피온산으로 변형된 Carnoy's 용액을 준비합니다. 수정된 Carnoy's 용액 한 방울에 먼지가 없는 슬라이드에 난소 한 쌍을 놓습니다. 해부 바늘로 난소를 약 6개의 섹션으로 나누고 MZ6 Leica 실체현미경 하의 깨끗한 슬라이드에 50% 프로피온산 방울에 넣습니다. 각 섹션에 대해 별도의 슬라이드를 사용합니다.
3. 바늘을 이용하여 절개하는 난포를 분리하고 해부 현미경으로 여과지나 종이 타월로 남은 조직을 닦아냅니다. 모낭에 50% 프로피온산을 한 방울 떨어뜨리고 실온에서 3-5분 동안 그대로 두십시오. 50% 프로피온산 방울 위에 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 약 1분 동안 그대로 두십시오.
4. 슬라이드를 여과지와 플라스틱으로 감쌉니다. Flex-Shaft 부착물과 3000-5000RPM 사이로 설정된 부드러운 플라스틱 팁이 있는 Dremel 200 회전 도구를 사용하여 팁을 원을 그리며 소용돌이치고 커버슬립을 가볍게 눌러 핵을 고르게 펴서 난포를 표현합니다. 이 단계는 약 1분 정도 걸립니다. 20x 대물렌즈를 사용하는 Olympus CX41 위상 현미경으로 확산 품질을 확인합니다.
5. 염색체를 덮고 있는 커버슬립 옆에 추가 커버슬립을 놓아 샌드위치를 준비하고 두 번째 현미경 슬라이드로 덮습니다. 이렇게 하면 바이스에서 슬라이드가 부서질 가능성이 줄어듭니다. 유리 슬라이드 용기와 여과지에 들어 있는 플라스틱 시트로 슬라이드를 감싸 샌드위치를 고정하고 바이스로 인한 슬라이드가 긁히지 않도록 보호합니다.
6. 기계적 바이스를 통해 슬라이드에 압력을 가합니다. 85-120인치-파운드의 압력으로 충분하며 토크 렌치를 사용하여 달성됩니다. 이 단계는 염색체를 가능한 한 많이 평평하게 만드는 데 필요합니다.
7. 두 번째 현미경 슬라이드와 추가 커버슬립을 제거합니다. 염색체를 덮고 있는 커버슬립이 있는 슬라이드를 슬라이드 변성/혼성화 시스템에서 55-15분 동안 10-15°C로 가열하여 염색체를 더욱 평평하게 합니다. 슬라이드를 액체 질소에 15초 이상 담그고 거품이 멈추면 면도날로 커버슬립을 빠르게 제거합니다. 즉시 슬라이드를 차가운 50% 에탄올에 5분 동안 넣습니다. 각각 5분 동안 70%, 90%, 100% 에탄올로 슬라이드를 탈수합니다. 공기 건조 슬라이드.

2. 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하는 FISH

프로그램은 프로브 라벨링을 제외한 다음 단계를 실행하도록 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템으로 설정됩니다. 자세한 nick-translation 라벨링 프로토콜은 Fermentas의 DNA 중합효소와 함께 제공되는 문서에 설명되어 있습니다.

1. FISH를 사용하기 전에 nick-translation protocol을 사용하여 게놈 BAC DNA를 형광 색소로 라벨링하여 형광 프로브를 준비합니다. DNA 1μg, 표지되지 않은 dATP, dCTP 및 dGTP 각각 0.05mM 및 0.015mM dTTP, 1μl Cy3- 또는 Cy5-dUTP, 0.05mg/ml BSA, 5μl의 10x nick-translation buffer, DNA polymerase I 20 units, DNase I 0.0012 units 및 nuclease-free water를 25 μl에 혼합합니다. DNA 중합효소 I/DNase I 비율은 300 - 500 bp 크기 범위의 프로브를 얻기 위해 경험적으로 선택됩니다. 혼합물을 15 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
2. 슬라이드와 시약을 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템에 넣고 프로그램을 시작하여 다음 단계를 실행합니다. 800μl의 1x PBS를 20분 동안 적용합니다. 바람은 공기로 미끄러집니다. 1x PBS에 4% 포르말린 450μl를 1분 동안 도포한 후 100% 에탄올로 1초 동안 2회, 2분 동안 한 번 세척하여 포르말린 고정을 수행합니다. 바람은 공기로 미끄러집니다.
3. 프로브를 적용할 때 거품이 발생하지 않도록 45°C에서 2분 동안 슬라이드를 가열합니다. DNA 프로브의 20 μl를 적용하고, 혼성화 용액의 증발을 피하기 위해 미네랄 오일 방울을 추가하고, 상단에 커버 슬립을 놓습니다. 90°C에서 10분 동안 슬라이드를 가열하여 염색체와 DNA 프로브를 변성시킵니다.
4. 하이브리드화의 경우, 커버슬립을 씌운 상태에서 42°C에서 14시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 혼성화 용액은 2x SSC, 100mM 인산나트륨, 1x 덴하르트 용액, 100μg/ml의 아지드화나트륨 및 포름아미드의 10% 덱스트란 설페이트로 구성됩니다.
5. 엄격한 세척을 위해 42°C에서 2분 동안 슬라이드를 가열하고 커버 슬립을 제거한 다음 2x SSC에서 1초 동안 슬라이드를 4회 세탁합니다. 바람은 공기로 미끄러집니다. 42°C에서 800μl의 0.4x SSC를 10분 동안 2회 적용합니다. 2x SSC에서 25°C에서 10분 동안 슬라이드를 세척합니다.
6. 1x PBS에 50μl의 1μM YOYO-1을 적용하여 염색체 염색을 수행합니다. 염색 용액의 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 바르고 커버 슬립을 착용하고 25 ° C에서 10 분 동안 배양합니다. 커버슬립을 제거하고 슬라이드를 2x SSC에서 1초 동안 4회 세척합니다. 바람은 공기로 미끄러집니다. ProLong Gold 퇴색 방지 시약 15μl를 바릅니다. 커버 슬립을 착용하십시오.

3. 자동 형광 이미징 시스템을 사용한 슬라이드 읽기

이 섹션에서는 ACCORD PLUS 자동 스캐닝 시스템에 기본으로 제공되는 Duet 소프트웨어의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 전원을 켠 후 할로겐 전구용 Olympus U-RFL-T 전원 공급 장치, 컴퓨터 Dell precision T3500, 연결된 카메라 Olympus U-CMAD3가 있는 현미경 Olympus BX61

.

1. 10x 사전 스캔을 설정하려면 ACCORD PLUS 자동 스캔 시스템에서 Duet 소프트웨어를 엽니다. "온라인" 버튼을 클릭합니다. 새 사례 ID를 입력하고 슬라이드 ID를 할당합니다. "BF"라고 표시된 점을 클릭합니다. 이것은 명시야 옵션입니다. 스캔 선택 항목을 "10x Prescan"으로 설정합니다. "2500x 원", "10000x 원" 또는 "직사각형"을 사용합니다. "Set&run"을 클릭하여 10x Pre-Scan을 수행합니다.
2. "확인" 버튼을 클릭하여 10x Pre-Scan을 실행합니다. 지시에 따라 스캔을 적절하게 조정하십시오. "마침"을 클릭하여 스캔을 시작합니다. "Main" 탭을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다. "오프라인" 버튼을 클릭합니다. 할당된 사례 ID와 슬라이드 ID를 찾아 "오프라인 스캔"을 클릭합니다. 왼쪽 상단 영역의 검은색 상자에서 화살표를 클릭하고 "10x Prescan"을 선택합니다. 화살표(< || Δ > 일명 "뒤로", "일시 중지", "재생", "앞으로" 버튼)를 사용하여 스캔한 이미지를 살펴봅니다.
3. 관심 있는 이미지를 찾은 후 대상 영역의 중간에 있는 화면을 두 번 클릭하고 "스냅"을 누릅니다. 이렇게 하면 나중에 캡처할 이미지를 대상으로 합니다. 모든 대상을 선택한 후 "분류"를 클릭합니다. "10x Prescan"을 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지를 분류할 수 있는 기회를 얻으십시오. "Polytene"을 선택합니다.
4. Duet 소프트웨어에서 40x 사전 스캔을 설정합니다. "Main"을 클릭하여 메인 메뉴로 돌아갑니다. "온라인"을 다시 선택합니다. 슬라이드를 선택합니다. "BF"를 "FL"로 변경합니다. 작업 이름을 "Revisit-X40-RG"로 변경합니다. 마지막 설정 바로 아래 섹션을 "Revisit-ALL"로 변경합니다. "Set&Run"을 클릭합니다. "확인"을 누릅니다. 프롬프트에 따라 자동화를 설정합니다. "일치하는 보기 시작" 버튼을 클릭하여 10x 및 40x 이미지를 일치시킵니다. "마침"을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 완료되면 "분류"를 클릭하고 이미지를 확인합니다.

4. 대표 결과

그림 1은 고압 염색체 제제의 계획을 그래픽으로 보여줍니다. 이 단계에는 Dremel 도구와 기계적 바이스를 사용하여 염색체를 찌그러뜨리고 평평하게 하는 과정과 위상차 현미경을 사용하여 염색체 시각화를 포함합니다. 그림 2는 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 염색체 슬라이드 제제의 DNA를 표적으로 하기 위한 형광 표지 프로브의 혼성화, FISH 실험 후 프로브를 시각화 및 매핑하기 위한 자동 스캐닝 현미경 사용, 염색체에 게놈 골격 배치 및 방향을 제시합니다.

An. gambiae의 암컷에서 채취한 난소 간호사 세포 polytene 염색체의 준비는 고압 기술을 사용하여 이루어졌습니다. 이 방법은 대부분의 염색체 구조를 손상시키거나 변경하지 않습니다(그림 3). 그것은 구부러진 염색체를 평평하게 하여 일반 제제에서 볼 수 없는 숨겨진 미세한 띠를 드러냅니다(그림 4).

이 프로토콜에 사용된 프로브는 An. gambiae PEST 균주 DNA에서 생성된 ND-TAM BAC 라이브러리에서 얻은 게놈 BAC DNA 클론입니다. 이 라이브러리의 게놈 DNA는 암수 모두의 새로 부화한 첫 번째 인스타 유충에서 추출되었습니다. 그림 5는 An. gambiae 의 polytene 염색체에 교잡된 BAC 클론을 사용한 FISH의 결과를 보여줍니다.이 절차는 Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 수행되었습니다. An. gambiae¹⁰에 대한 세포유전학적 포토맵을 사용하여 두 개의 BAC 클론 102B24(GenBank: BH372701, BH372694) 및 BAC 142O19(GenBank: BH368703, BH368698)를 각각 2R 암의 하위 분할 16C 및 16D에 국한시켰습니다. 그러나, An. gambiae PEST 균주 AgamP3 어셈블리 ¹⁴에 대한 BLAST 검색은 2R 암의 서브디비전 16B 및 17A에서 각각 102B24 및 142O19와 상동적인 서열을 확인했다(표 1). 따라서 게놈 좌표와 세포유전학적 세분화 간의 대응은 이제 매핑 데이터에 따라 조정될 수 있습니다. An. gambiae M 형태 및 S 형태 게놈 어셈블리에 대한 BLAST 검색은 두 개의 BAC 클론이 서로 다른 contigs에 위치하지만 각 형태 내에서 동일한 골격에 있음을 발견했습니다(표 1). 식별된 콘티그는 이제 특정 염색체 위치와 연관될 수 있습니다. 더욱이, 식별된 골격은 이제 세포학적 세분화(16CD) 내에서 적절하게 배향될 수 있습니다. 흥미롭게도, 스캐폴드에서 102B24 및 142O19 염기서열 사이의 거리는 PEST 균주, M-형태 및 S-형태 게놈 어셈블리에서 각각 1,892,981 bp, 1,658,391 bp 및 1,688,426 bp입니다. PEST 균주는 M과 S 형태의 하이브리드이기 때문에 이러한 차이는 PEST 게놈의 잘못된 조립으로 인한 것일 수 있습니다.

<테이블 테두리="1"> BAC
(가입) 해충 균주
AgamP3

좌표 M 형
contigs

좌표 M 형
비계

좌표 S-form
contigs

좌표 S-form
비계

좌표 102B24
(BH372694) 2R:AAAB0100
8844_26 (16B)

43,681,342-
43,681,874명 ABKP020247
53.1

32,513-
33,045명 EQ090167.1

1,858,377-
1,858,909 ABKQ010123
32.1

4,299-
4,832명 EQ099711.1

215,891-
216,424명 102B24
(BH372701) 2R:AAAB0100
8844_28 (16B)

43,788,213-
43,788,969명 ABKP020247
51.1

24,816-
25,575명 EQ090167.1,

1,772,683-
1,773,442명 ABKQ010123
35.1

27,782-
28,540명 EQ099711.1,

305,514-
306,272명 142O19
(BH368698) 2R:AAAB0100

8805_5 (17A)
45,428,580-
45,429,264명 ABKP020247
01.1

2,499-
3,185명 EQ090167.1

315,806-
316,492명 ABKQ010123
76.1

49,242-
49,942명 EQ099711.1

1,791,625-
1,792,325명 142O19
(BH368703) 2R:AAAB0100
8805_8 (17A)

45,560,099-
45,574,323명 ABKP020220
17.1

30,971-
32,469명 EQ090167.1
200,518-
202,016명 ABKQ010123
79.1

27,760-
28,508명 EQ099711.1

1,903,569-
1,904,317명

표 1. An. gambiae의 게놈 어셈블리에 대한 BAC 말단 서열의 BLAST 결과.

그림 1. 고압 염색체 준비의 개략도. 모기의 난소는 올바른 발달 단계에서 나타납니다.

그림 2. 자동화된 FISH, 슬라이드 스캐닝 및 게놈 스캐폴드의 염색체 매핑을 나타내는 체계입니다.

그림 3. 고압 기술을 사용하여 얻은 An. gambiae의 polytene 염색체 3의 확산. 3L과 3R은 텔로미어에서 왼쪽과 오른쪽 팔을 표시합니다. PH와 IH는 각각 pericentric 및 intercalary heterochromatin을 나타냅니다.

그림 4. 전통적(위) 및 고압(아래) 기술을 사용하여 준비된 An. gambiae polytene 염색체의 비교. 이미지는 암 3R(A)의 하위 분류 29A-30E 및 암 3L(B)의 43D-46D를 다룹니다.

그림 5. BAC의 FISH는 An. gambiae의 polytene 염색체로 복제됩니다. A) 102B24(적색 신호)와 2R 암의 혼성화. B) 102B24(빨간색 신호) 및 142O19(파란색 신호)의 이중 색상 FISH를 각각 늘어난 2R 암의 16C 및 16D로 세분화합니다. 화살표는 Cy3(빨간색) 및 Cy5(파란색)로 표지된 BAC 클론의 혼성화 신호를 나타냅니다. C-중심체 영역. a/+는 이형접합체 2La 반전을 보여줍니다. 염색체는 형광단 YOYO-1로 대조 염색되었습니다.

Discussion

고압 절차의 가장 중요한 단계는 난소 발달의 Christophers' III 단계에서 분리된 난소 간호사 세포를 적절하게 분쇄하는 것입니다¹³. 부적절한 스쿼싱은 염색체가 불충분하게 퍼질 수 있으며, 이는 FISH 후 프로브 위치를 결정하려고 할 때 문제를 일으킬 수 있습니다. 염색체가 과도하게 찌그러지면 줄무늬 패턴이 손실될 정도로 부러지거나 길어질 수 있습니다. 여러 슬라이드를 생산하면 Dremel 도구를 사용하여 슬라이드를 스쿼싱하려고 할 때 일관성이 유지되어야 하며, 이는 전반적인 슬라이드 생산 효율성을 높입니다. 고압 기술은 D. melanogaster⁹의 갓 분리된 침샘을 위해 처음 개발되었습니다. 그러나 모기의 난소는 염색체 제제에 사용하기 전에 변형된 Carnoy's 고정 용액(3메탄올: 1 빙초산)에서 일상적으로 보존됩니다. 따라서 우리는 말라리아 모기 An. gambiae의 고정 난소 간호사 세포 폴리텐 염색체에 적합하도록 기존 고압 프로토콜을 수정했습니다. 전체 슬라이드의 작업 표면이 매우 평행한 정밀 바이스를 사용하여 고압을 가하기 때문에 연필 지우개로 전통적인 두드리는 기술을 사용하는 것보다 염색체 스쿼시를 준비하는 데 훨씬 적은 시간이 걸립니다.

다른 중요한 단계로는 모낭을 50% 프로피온산에 충분히 담그고 슬라이드를 가열하는 것이 있습니다. 이 두 단계 모두 염색체를 평평하게 만드는 데 필수적입니다. 이를 무시하면 탈수 후 염색체가 반짝이는 것처럼 보일 수 있으며, 이는 잠재적으로 FISH의 신호로 오인될 수 있는 과도한 배경으로 이어질 수 있습니다. 고압 스쿼싱 기술은 유사분열 염색체 준비를 할 때 동일한 용액을 사용하여 잘 작동합니다. 추가적인 확산 및 평탄화는 핵에서 염색체를 더 잘 발현하는 데 도움이 됩니다. 동일한 압력을 가하면 그에 따라 평평해져야 측정이 가능하고 염색에서 볼 수 있는 밴드의 해상도가 향상될 수 있습니다. 모기로부터 유사분열 염색체를 분리하는 방법에 대한 자세한 내용은 다른 곳에 나와 있습니다¹⁵. 일반 스쿼시 제제는 FISH ¹⁶ 및 면역염색¹⁷을 포함한 많은 목적에 충분하지만, 고압 방법은 한 슬라이드에서 다음 슬라이드로의 잠재적 차이를 낮출 뿐만 아니라 전반적인 염색체 품질을 향상시켜 염색체를 매핑할 때 더 높은 세부 정보로 이어집니다. 이 절차는 레이저 캡처 미세해부를 위한 폴리텐 염색체 막 슬라이드를 준비하는 데에도 사용할 수 있습니다.

고압 방법의 한계에는 슬라이드 파손 및 염색체의 과도한 스트레칭이 포함됩니다. 바이스를 통해 슬라이드에 너무 많은 응력을 가하여 슬라이드가 파손될 수 있지만 기사에 표시된 압력을 사용하여 제한됩니다. 염색체가 과도하게 늘어나는 경우 Dremel 도구를 슬라이드에 장시간 적용하면 염색체가 너무 늘어나 해상도가 떨어질 가능성이 있습니다. 이것은 짧은 시간 동안 도구를 적용하고, 현미경으로 확인하고, 염색체가 충분히 퍼지지 않은 경우 Dremel 도구로 더 많은 시간을 적용하여 해결할 수 있습니다.

전통적인 FISH 프로토콜에는 일반적으로 5-20분 길이의 여러 세척 및 배양 단계가 포함되며 전체 실험 기간 동안 연구원의 거의 완전한 주의가 필요합니다. 또한 수동으로 처리할 수 있는 슬라이드의 수는 일반적으로 주어진 실험에서 몇 개의 슬라이드로 제한됩니다. 대조적으로, 자동 슬라이드 염색 시스템은 모든 단계(세척, 배양, 프로브 적용, 변성, 혼성화, 커버슬립 적용 및 제거 포함)를 자동으로 수행합니다. 이를 통해 FISH 실험 연구원은 최대 6-8시간 근무할 수 있습니다. 또한 자동화된 FISH 시스템은 처리량을 크게 늘릴 수 있습니다. 예를 들어, Xmatrx 시스템은 단일 준비 슬라이드에서 최대 40개의 분석과 이중 준비 슬라이드에서 최대 80개의 분석을 동시에 처리할 수 있습니다. 이 시스템의 한계 중 하나는 대량의 용액을 준비해야 하기 때문에 소수의 FISH 실험에는 효율적이지 않다는 것입니다. 또한 시스템에 프로그래밍된 FISH 프로토콜은 새로운 응용 프로그램에 대한 수정 및 조정이 필요할 수 있습니다.

슬라이드 스캐닝 시스템은 형광 현미경의 자동화 버전입니다. 자동화된 스테이지 이동과 간단한 현미경 제어판은 연구원의 시간을 절약하고 현미경 작동을 매우 간단하게 만듭니다. 예를 들어, ACCORD PLUS 스캐닝 시스템의 소프트웨어를 사용하면 여러 채널의 형광을 쉽게 캡처하고 이미지 획득을 쉽게 관리할 수 있습니다. 이에 대한 예는 단일 이미지를 촬영하는 대신 z-스택 캡처를 포함하는 것입니다. 이 소프트웨어는 구성 가능한 이미지 Z-스택을 캡처하여 하나 이상의 이미지에 초점이 맞춰지도록 합니다. 이 시스템은 다중 이미지 획득(단일 슬라이드에 많은 세포)을 위해 더 많이 만들어졌지만 슬라이드를 수동으로 탐색하는 것보다 슬라이드에서 염색체를 찾는 것이 훨씬 쉽습니다.

자동 슬라이드 염색 시스템과 스캐닝 시스템은 모두 세포유전학 클리닉에서 인간 세포의 염색체 이상에 대한 FISH 진단에 일상적으로 사용됩니다. 본 연구에서는 이러한 자동화 시스템을 기초 연구 응용에 활용하는 프로토콜을 개발했습니다. 자동화된 고처리량 물리적 매핑 프로토콜은 관심 있는 모든 종에 대한 물리적 염색체 지도의 신속한 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 보고서에서는 물리적 매핑을 위해 폴리텐 염색체를 사용했지만 유사분열 염색체도 이러한 시스템과 함께 활용할 수 있습니다. 대부분의 유기체가 읽을 수 있는 폴리텐 염색체를 발달시키지 않기 때문에 프로토콜을 유사분열 염색체에 맞게 조정하는 것이 유용할 것입니다. 그러나 폴리텐 염색체가 사용 가능한 경우 가장 높은 해상도에서 염색체 구조와 기능적 게놈 도메인의 일치에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 밴드 및 인터밴드의 패턴과 같은 폴리텐 염색체의 조직 원리는 최근 규칙적인 비폴리텐(간기) 염색체의 조직 원리에 비유되었습니다¹⁸. 따라서 고압 염색체 준비에 대해 수행되는 상세한 물리적 매핑은 DNA 서열을 밴드, 인터밴드, 퍼프, 중심체, 텔로미어 및 헤테로크로마틴과 같은 특정 염색체 구조에 연결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 염색체 기반 게놈 어셈블리를 생성합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22x22mm 현미경 커버 슬립	Fisher	12-544-10
18x18mm 현미경 커버 슬립	Fisher	12-553-402
아세트산	Fisher	A491-212
메탄올	Fisher	A412-4
프로피온산	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 Flex-Shaft가 있는 로터리 공구 첨부 파일	Rand		3" 다목적 미니 벤치 그라인더 (속도 제한기 포함)
특별히 설계된 200 μ l 플라스틱 팁 (구슬 플라스틱 가장자리) Dremel 도구	Pipetman	F171300	절단 및 열 지방 피펫 팁 끝
주석 코팅 빠른 바이스	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	정밀 접지 사각형 및 평행 0.00025
토크 렌치	Craftsman	44593
ThermoBrite 슬라이드 변성 / 하이브리드화 시스템	Abbott 분자	30-144110
25mm 배리어 슬라이드	Abbott Molecular	XT108-SL
25mm 커버슬립	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx 자동 슬라이드 염색 시스템	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Leica 실체 현미경	Leica	VA-OM-E194-354	다른 실체 현미경을 사용할 수 있습니다
Olympus CX41 위상 현미경	Olympus	CX41RF-5	다른 위상 현미경을 사용할 수 있습니다
ACCORD PLUS Automated Scanning System	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (neutral buffered formalin)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamide	Fisher Scientific	BP227500
Dextran sulfate sodium salt	Sigma	D8906
20x SSC 버퍼	Invitrogen	AM9765
인산나트륨	Sigma-Aldrich	S3264
50x Denhardt 용액	Sigma-Aldrich	D2532
아지드화나트륨	Sigma-Aldrich	S2002
Invitrogen	Y3601	의 1mM YOYO-1 요오드화물(491/509) 용액
ProLong Gold 퇴색 방지 시약	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA polymerase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521