Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

요약

planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

초록

planarian, 담수 flatworm은 metazoan 재생 및 줄기 세포 생물학 ^1,2를 해부를위한 강력한 시스템을 것으로 입증되었습니다. 모든 없거나 손상된 조직의 Planarian 재생이 neoblasts ³ 되나 성인 줄기 세포에 의해 가능하게된다. 이러한 줄기 세포는 정말 로요 pluripotent과 전체 동물 ⁴ reconstituting의 singularly 가능한 것으로 표시되었습니다 있지만, 줄기 세포 인구와 그 세포 행동의 역학 내에서 이질이 크게 해결되지 않은 상태로 유지됩니다. 큰 번호와 planarian 본문 계획 전반에 걸쳐 줄기 세포의 광범위한 배포로 인해 생체내 분자와 기능성 연구를 위해 줄기 세포의 subpopulations 조작을위한 고급 방법이 필요하다.

조직 이식과 부분적인 조사는 planarian 줄기 세포의 subpopulation가 진학 격리 수있는가 두 가지 방법이 있습니다. 각 기술은 뚜렷한 장점이 있습니다. 티문제는 이식도 본질적으로 유전적으로 뚜렷한 있거나 이전에 pharmacologically 처리되었습니다 순진 호스트로, 줄기 세포의 도입을 허용합니다. 또한, 부분 조사는 상처의 도입이나 조직 통합에 볼기없이 줄기 세포를 찾아볼 수없는 조직으로 juxtaposed 호스트 내에서 줄기 세포의 고립을 허용합니다. 이러한 두 가지 방법을 사용, 하나는 세포 자율이 아닌 자율적인 요인을 조사할 수 있도록 증식, 분화, 및 마이 그 레이션과 같은 제어 줄기 세포 기능.

조직 이식 ^5,6와 부분적인 방사선 ^일곱 모두 오늘날 공부 밑에 남아 planarian 중생에 대한 질문이 많은 정의에서 역사적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술은 이전 방법의 힘드는과 일관성없는 성격으로 인해 underused 살아남았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 시간 감소에 앞으로 큰 단계를 나타냅니다차 reproducibly 100 %에 접근 efficacies로 이식할 또는 부분적으로 조사 동물의 다수를 생성하기 위해 필요한 노력. 우리는 큰 동물의 문화, 부동화, 부분 조사, 조직 이식을위한 준비, 그리고 동물의 복구 최적화를 포괄합니다. 또한, 여기에 설명된 작업은 가장 널리 연구 planarian, Schmidtea 메디 테라 니아와 함께 사용하기위한 부분적인 조사 방법의 첫 번째 응용 프로그램을 보여줍니다. 또한 planaria에 접목 효율적인 조직은 오래 포유류 ⁸ 성인 줄기 세포의 잠재력을 시금의 골드 표준 방법되었습니다 repopulation의 assays의 순진하거나 치료 줄기 세포의 subpopulations의 기능 테스트를위한 문을 엽니다. 이러한 기술의 광범위한 채택은 조직 항상성 및 재생 중에 성인 줄기 세포의 세포 행동의 이해에 리드 의심하지 않습니다.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 잠재적으로 유해 물질의 사용 (리드와 chloretone)을 제안합니다. 수집, 읽기 및 모든 잠재적 유해 물질에 대한 MSDS를 따릅니다.

1. 동물 문화, 선택 및 준비

1. 동물 문화와 처리 사용 planarian 워터 (1X Montjuïc 소금 ⁹⁾ 및 플라스틱 전송 pipettes하십시오.
2. 정상적인 배양 조건 하에서 ¹⁰ 연구실에서 제기했을 때 성적 생물형 Schmidtea 메디 테라 니아 사용할 수 있습니다. 필요한 크기의 성별이없는 표본을 제작하려면, S. 메디 테라 니아 ^9는 사용하기 전에 1~2개월 동안 트리플 정상 주파수 (2-3 번 주당)으로 이중에서 먹이되어야 정상적인 조건에서 실내 온도에서 키웠습니다. 또는 정상적인 주파수에서 먹이 성별이없는 동물들의 평균 크기를 향상시키기 위해 무기한 섭씨 10 도에 보관 수 있습니다.
3. 관련 1~2센티미터 사이에있는 동물을 선택길이 2mm보다 넓게 그리고 동물에게 사용하기 전에 3-7일을 굶어.
4. 대상 호스트, 기증자, 또는 부분적으로 조사 동물에 대한 pharmacological이나 방사능 치료를 수행하는 경우이 시점에서 치료 (들)을 수행합니다.
5. pharmacological 치료가 동물에게 먹이를 요구하는 수행한다면, 동물에게 사용하기 전에 추가로 3~7일을 굶어.

2. 솔루션 및 재료 준비

1. planarian 물에 0.1-0.2 % W / V chloretone을 해소하고 얼음에 솔루션을 장난으로 chloretone 솔루션, 가벼운 국소 마취제를 준비합니다.
2. 부분적인 조사를 수행하는 경우에만, 2.7 단계로 진행합니다. 조직 이식의 경우 2.3 단계로 진행합니다.
3. 분젠 버너 사용 1-2센티미터에서 그라 프트, 90 모세관 튜브 ° 각도를 받게됩니다 호스트에 구멍을 만드는 데 사용되는 이식 조직을 절단에 사용되는 0.75 mm 내부 직경, 그리고 0.7 mm 외부 직경을 굽히다 EA의 끝에서채널 튜브. 자료를 저장하려면 각 모세관 튜브의 양쪽을 구부 두 도구를 생산하는 반으로 그들을 깰. 화염 튜브 매우 엔드로되지주의를 기울입니다.
4. 지정된 크기에 다음 서류를 잘라 :
   • 블랙 필터 페이퍼 (. 2.5 cm는 x 1.5 cm 사각형 약으로 절단)
   • 워트 먼지 # 3 필터 페이퍼 (. 2cm X 0.5 cm 사각형 약으로 절단)
   • Kimwipe (접혀 및 덩어리 정말 끝내줘 약으로 했네요. 3cm X 0.5 cm × 4 겹의)
   • 담배 압연 종이 (고무 스트립을 제거하고 사각형 약으로 했네요. 3cm는 x 2cm)
5. 수정된 Holtfreter의 솔루션 (3.5 G / L NaCl 0.2 g / L NaHCO _3, 0.05 G / L KCl 0.2 g / L MgSO _4, 0.1 G / L CaCl _2, 산도 7.0-7.5) 준비 및 카세 인은 Holtfreter의 솔루션과 감기 포화 4 모두 ° C.
6. Peltier 쿨러 플레이트 또는 해부 현미경에 위치한 다른 냉각 장치의 Parafilm의 광장과 장소로 접힌 Kimwipe을 첨부합니다. 냉장 Holtf과 Kimwipe를 포화reter의 솔루션과 장소 Kimwipe에 두 개의 검은 필터 종이 사각형.
7. 워트 먼지 필터 # 2 종이 라인 배양 접시. Holtfreter의 솔루션과 여과지를 축축하게하다 얼음에 요리를 진정 하라구. 부분적인 조사 내용은 큰 접시 및 필터 종이 라이너를 사용할 수 있습니다.

3. Anesthetization 및 고정

1. 그릇에 냉장 chloretone 솔루션과 피펫 웜있는 페트리 접시를 채우십시오. 이식의 경우 하나의 호스트와 한 번에 한 기증자를 마취. 부분적인 조사 내용은 여러 (N> 10) 동물들은 한 번에 anesthetized 될 수 있습니다.
2. 그들은 움직이지 될 때까지 웜은 chloretone 용액에 흡수하도록 허용 (5-10 분).
3. 냉장 Holtfreter의 솔루션 가득한 그릇에 그들을 pipetting하여 벌레를 씻어.
4. 냉장 Holtfreter의 솔루션 및 포셉과 동양 그들에게 복부 측면을 아래와 포화 블랙 거름종이에 그들을 pipetting하여 동물을 고정. 동물 LOC 수있다면오모테, 과잉 Holtfreter의 솔루션을 흡수, 약간 귀하의 Peltier이나 차가운 접시의 온도를 줄이거나 chloretone 치료의 길이를 증가시킵니다.

4. 부분 조사

참고 : 부분적인 조사를 위해 동물을 준비하려면 다음 단계를 따르십시오. 대신 이식을 수행하는 경우, 섹션 5로 진행합니다.

1. X 선 irradiator 상위 소스 내부에 맞게 아이스 버킷에 얼음 단계 2.7에서 냉장 배양 접시를 놓습니다.
2. 그들이 고정화되어있는 검은 여과지를 이동하여 배양 접시에있는 anesthetized 동물을 마련. 직접 anesthetized 벌레를 이동하는 집게를 사용하여 그들을 다치게 수 있습니다.
3. 교통은 X 선 irradiator 최상위 소스에 동물을 배치하고 동물에 대한 음극 관의 거리가 최소화되는 등 얼음 양동이를 ...을 놓다, 따라서 효과적인 복용량 속도를 극대화.
4. 동물과 음극 t 사이에 위치 납 차폐 (들) (그림 1)ube이 원하는대로. 방어막이 325kV X 선 빔 ¹¹ 97~99% 감쇄 수 있도록 두께가 4.5-6 mm이어야합니다.
5. X 선 선량을 전달합니다. 비 차폐된 지역의 전체 줄기 세포 절제를 원하는 경우, X 선 irradiator를 사용하여 30 GY 이상을 제공합니다. 참고로, 30 GY 320 kilovolts에서 3.6 분, 30cm의 현장 - 투 - 소스 거리와 정밀 X-레이 주식 회사 XRAD320 10 milliamps와 동일합니다.
6. 즉시 먹이지 후 냉장 planarian 물에 블랙 필터 종이, 전송 동물로 벌레를 취급 완료된 것입니다. planarian 물이 검은색 거름종이으로부터 자신을 꺼내려 실내 온도와 동물 따뜻하게하도록 허용합니다. 부분적인 조사 절차가 완료되었습니다.

5. 조직 이식

1. 트랜스퍼 피펫과 집게를 사용하여 Pelti에 냉각되어 Kimwipe의 검은 필터 종이를 별도의 사각형에 anesthetized 호스트 및 기증자 웜을 마련해부 현미경 음이나 쿨러 플레이트.
2. 0.75 mm 내경 모세관을 사용하여 기증자로부터 이식 플러그를 자르고, 집게를 사용하여 호스트의 방향 부분의 아웃에 배치하십시오. 그라 프트 자료가 모세관 튜브에 걸리면, 포셉로 이동시키다.
3. 0.7 mm 외경 모세관이 호스트에서 플러그를 제거를 사용하고 뒤에 남은 구멍으로 포셉 위치 이식편을 사용합니다.
4. 2.7 단계에서 준비 페트리 접시에 자사의 블랙 필터 종이 사각형에 이식된 호스트를 전송합니다.
5. 카세 포화 Holtfreter의 솔루션을 통해 롤링 종이 조각을 습식 및 그림 2A에서 diagramed로 이식된 호스트의 상단에 배치하십시오.
6. 카세 포화 Holtfreter의 솔루션과 그림 2B에 diagramed로 이식된 호스트 상자에 넣다 거름종이 네 가지 조각을 만끽해보세요.
7. 카세 포화 Holtfreter의 솔루션에서 컷 Kimwipe 네 가지 덩어리 정말 끝내줘를 적시게하고 그들을 이상하다5.6 단계에서 여과지 (그림 2B). 뚜껑을 교체하고 얼음에 페트리 접시를 넣어.
8. planarian 물, 복구 치유, 그리고 재생하는으로 기증자 웜을 전송합니다.
9. 모든 이식이 완료되면 야간 10 ° C 배양기에 이식된 벌레를 놓으십시오.
10. 다음 아침, 돌보는 것은 그라 프트 방해 웜을 발견하고 planaria 물을 가득 배양 접시에 (의 검은 필터 종이에) 그것을 전송하는 방법 않습니다.
11. 어느 웜이 여과지에서 자신을 이동시키다거나 살짝 집게로 제거하실 수 있습니다.
12. 2~3일마다 한 번씩 planarian 물을 변경합니다.

6. 대표 결과

즉시 부분 방사선 planaria를 따라하는 것은 정상 및 영향을받지 나타납니다. 배달 복용 및 사용 방패의 형상에 따라 조사 조직 복귀 심지어 ^7을 분해 수 있습니다. 차폐 조직은 그대로 유지됩니다. Foll인하여 조직 회귀 및 조직 무결성의 손실, 아체가 형성되고 누락된 구조는 (그림 3A) 다시 생성됩니다. 절단이 부분적으로 조사 지역에서 만들어진 경우, 조사 조직은 (그림 3B) (즉 regressing 또는 약해 방해) 구출됩니다. 손상되지 않은 및 절단 비 조사 planaria (그림 3C)에 비해 절단의 경우 재생이 지연됩니다. 모두에서 30 GY의 X 선 선량이 전달하고 부분적으로 조사 동물 사용된 리드 방패로 대응이 줄기 세포에 대한 원위치 하이브리드화에 의해 부분적인 조사에 따라 2~3일 확인할 수있는 패턴의 손상되지 않은 성공적인 줄기 세포 절제였다 경우 마커 Smed-piwi-1 ¹² (일명 smedwi-1) (그림 4).

이식, 이식된 조직의 성공적인 이식 따라 아침 분명한 w되어야호스트 (그림 5A)의 지느러미와 복부 표면에 모두 준수 있고, 호스트 조직을 ithin. 종종 이식은 복부 또는 지느러미 표면을 준수합니다. 이식 완전히 실패하면 이식편의 흔적은 호스트 (그림 5B) 중 하나 지느러미 또는 복부 표면에서 볼 수 없게됩니다. 곧 Smed-piwi-1 (그림 5C 주로 그래프트 내에 줄기 세포가 존재임을 밝히지 않습니다위한 원위치 하이브리드화에 치명적인 방사선 ^13,14에 의해 줄기 세포 ablated되었던 호스트에 비 조사 조직의 성공적인 이식을 따라 ). 또한 lethally 조사 호스트로 비 조사 조직의 성공적인 이식 호스트 조직 및 호스트 ¹⁵ 장기 생존의 구조가 높아집니다.

1 그림. 기본적인 구성 요소의 일반적인 배치부분적인 조사를위한 S는. 최고 위치를 X 선 소스와 X 선 irradiator에서 (음극 관) anesthetized planarian는 방사선 분야에서 직접 X 선 소스 아래에 위치하고 있습니다. X 선 선량 율을 극대화하기 위해서는 planarian 및 X 선 소스 사이의 거리는 최소화되어야한다. 납 차폐가 음극 관과 실천 등 웜에 가장 가까운 anesthetized 웜, 사이에 위치해야합니다. 리드 방어막 제조, 설계 및 배치되어야하므로 그것이 방패 원하는 조직을 하긴하지만 완전히 벌레의 나머지 부분은 제공합니다. 대부분의 상업은 심플한 디자인 다이어그램에서 사용자 지정 리드 보호막을 생성합니다 제조, 우리는 성공적으로 알파 시스템 주식 회사 (Bluffdale, UT)를 사용 하였다. 리드는 방어막의 원하는 금액을 할 수 있도록 충분한 두께가 있어야합니다. 320 kV X 선 빔의 차폐 완료 근처​​가 원하는 경우 예를 들어, 리드는 두께 4.5-6 mm이어야합니다. planarian와 방패가에 위치하고 있습니다Holtfreter의 젖은 거름종이는 얼음 양동이에 달려있다 페트리 접시를 정렬했습니다. 충분히 큰 X 선 방사선 분야와 동일 리드 방패의 수를 감안할 때, 많은 표본이 부분적으로 한 번에 (사진에 없음)에서 반구 수 있습니다.

그림 2. 복구 챔버를 구축. 조직 이식 복구 챔버 () 분해도, 카세 포화 Holtfreter의 솔루션에 배어 후에 서로의 위에 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있는 구성 요소를 모두 보여주고 있습니다. (B) 워트 먼지의 연동 배치를 보여주는 거의 완성 복구 챔버, # 3 필터 종이를 직사각형있는 석판이 anesthetized planarian 상자에 넣다, 치유 기간 동안 운동을 방지. 복구 챔버주의 건설 조직 이식의 신속한 치유와 큰 효능을 증진, 동물의 움직임과 탈수를 방지합니다.

그림 3. 간단한 후부 부분 조사의 대표 성과. Dubois는 ⁷ 설명한 바와 같이, (A) planarians의 뒷부분 절반 리드와 차폐 후 X-레이 방사선에 노출되었을 때 앞부분은 조직이 조사와 차폐된의 경계에 다시 복귀하기 위해 관찰되었다 조직되는 시점 unpigmented blastemas는 형성과 동물 재생하기 시작했다. (나) 한편, 동물 (A), 조직 회귀가 관찰되지 않았습니다 나머지 조사 앞쪽에 휴지가 구출되었다에서 수행한 동일한 부분적인 조사에 따라 목이 잘린 때. unirradiated 참수 컨트롤 (C)에 비해 부분적으로 조사 동물의 재생 헤드를 (B) 목이 잘린 그러나 중생이 크게 지연되었다.

4 그림. 대표 outco일부 줄기 세포 절제의 나 부분적인 조사를 수행. 줄기 세포 마커 Smed-piwi-1에 대한 원위치 하이브리드화 (좋겠어) 전체적으로 마운트 그 야생 유형 planaria를 보여 줄기 세포로 앞부분은 조직의 예외와 함께 그들의 시체를 분배했습니다 photoreceptors (화살촉)와 인두 적절한 (별표) ^14. () 조사했지만 완전히 차폐된 컨트롤에 Smed-piwi-1을 기원 planaria 레이저도 다음 세 가지 일 야생 형 planaria의에서 구별할 수있는 줄기 세포 분포를 보여줍니다 고쳤어요. (나) 한편, 앞부분과 뒷부분 노출을 떠나, 오직 부분적 차폐되었다 동물 Smed-piwi-1을 기원뿐만 아니라 줄기 세포가 아닌 차폐된 지역에서 ablated하는 조사 프로그램에 따라 삼일 떠나지 않았습니다 . 스케일 바 500 미크론이다.

그림 5. EXA성공과 실패 조직 이식의 mples 있습니다. () 사흘 이식에 따라 성공적으로 이식 planarian의 지느러미와 복부의 전망 이미지를 살고 있습니다. 이식편은 (표시된) 지느러미와 복부 표면 모두에서 명확하게 볼 수 있고 그래프트 - 호스트 인터페이스에서 특성 unpigmented 조직으로 둘러싸여 있습니다. (B) Correspondingly, 실패 transplantations는 이식 사이트 (지시)에서 눈에 띄는 그래프트 조직을 표시하지 않고 대신에 실패한 이식의 치유, unpigmented, 가로 상처를 보여줍니다. 오직 지느러미 또는 복부 표면에 부합 그라 프트는 (a) 다른에서 볼 때 한쪽과 실패 이식 (B)에서 본 성공적인 이식과 유사합니다. (C) 야생 유형 (wt) 조직은 주민 줄기 세포와 이식된 줄기 세포의 ablated되어 조사 호스트로 이식할 때 나중에 이식 따라 Smed-piwi-1 이틀 동안 소원에 의해 발표되어이식의 성공 여부는 명확에만 이식 위치 (화살촉) 또는 주위 간세포의 구체적인 존재에 의해 표시됩니다. 스케일 바 500 미크론이다.

토론

고정의 중요성

고정이하여 지금까지 이러한 프로세스 중 하나의 성공적인 완성을위한 가장 중요한 단계입니다. planaria 부적 절한 부분적인 조사에 앞서 움직일 수있다면, 그들은 일관성과 혼란함을 주죠 결과를 생산, 리드 방패 아래에 이동할 수 있습니다. 동물이 충분 이식에 따라 움직일 수있다면 또한, 호스트 웜은 가능성이 호스트에 적절하게 치료 이식의 실패 결과, 이식 조직에서 떨어져 이동합니다. 적절한 고정이 chloretone 치료 농도 또는 길이를 조절하여 달성 및 필터 종이의 온도와 습기있는 planaria의 휴식. 있습니다 최대 1.5 시간까지 0.2 %에서 Chloretone 치료 독성으로 나타나지 않는 그러나, 그 길이의 치료 방법 인두의 방출을 유도하고 있습니다. Planaria는 시간의 기간 동안 계속하고 부분적인 조사에 대한 의무가 남아 있습니다. 우리의 경험이 보여주었다 그너무 건조하고 동물 마르다 것이다; 너무 무리와 동물이 쉽게 이동 - 수분, 오히려 ch...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
범용 전송 피펫	Samco	691
모세관 튜브 (ID 0.75 ㎜)	FHC	30-30-0
모세관 튜브 (OD 0.7 ㎜)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34,155	VWR	500029-891
블랙 여과지	Schleicher & Schuell	10310809
워트 먼지 # 2 필터 용지 1002-055	피셔 과학	09-810B
워트 먼지 # 3 필터 용지 1003-185	피셔 과학	09-820E
담배 압연 종이	지그재그 - 지그재그의 한 변, 원래	NA
페트리요리	VWR	82050-544
집게 뒤몽, INOX # 5	FST	11251-20
Chloretone	시그마 알드리치	112,054
카세인	시그마 알드리치	C3400
보호막 리드	알파 시스템 주식 회사, Bluffdale, UT	맞춤 설계
XRAD-320 생물 Irradiator	정밀 X-레이, 노스 Branford, CT	NA