기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명 비켜에서 electroporation. 이 기술은 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화의 다양한 측면을 연구하는 데 관심있는 유전자의 효율적인 표현을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
복부 midbrain 제어 운동에 위치 Dopaminergic 뉴런, 정서적 행동, 및 보상 메커니즘 1-3. 복부 midbrain dopaminergic 신경 세포의 기능 장애는 파킨슨병, 정신 분열증, 우울증 및 치매 1-5 연관되어 있습니다. 따라서, midbrain dopaminergic 신경 세포의 분화의 조절을 연구하는 것은 midbrain 개발 및 신경 전구 운명 사양을 조절 메커니즘에 중요한 통찰력을만을 제공할 수 없습니다뿐만 아니라, 인간의 신경 장애의 다양한 치료를위한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이됩니다.
Dopaminergic 뉴런은 배아 복부 midbrain의 심실 영역에 즐비한 신경 progenitors에서 차별화. 신경 progenitors의 개발은 유전자 발현 프로그램 6,7에 의해 제어됩니다. 여기 (일 햄버거 해밀턴 (HH) 무대 11 midbrain에서 구체적으로 유전자를 표현하는 electroporation을 활용한 기술을보고irteen somites, 42 시간) 여자는 배아 8,9. 여자는 태아의 외부 개발은 나중에 발달 타임 포인트 10-13에서 결정된 효과를 특정 배아 단계에서의 편리하고 실험적인 조작을 위해 수 있습니다. 이전 HH 스테이지 13 (열아홉 somites 48 시간)보다 칙 배아 신경 튜브는 신경 시스템의 서로 다른 세포 유형으로 구별 능력이있다 multipotent 신경 progenitors로 이루어져 있습니다. CMV 프로 모터와 여자는 β-actin 향상제 모두 포함 pCAG 벡터는 국기 또는 배아 병아리 신경 튜브 14 기타 에피토프 태그가 추가된 구조의 강력한 표현을 허용합니다. 이 보고서에서 우리는 유전자가 배아 midbrain 지역으로 구체적으로 구성하고 어떻게 소규모 맞춤 전극과 electroporation를 정확하게하는 투입 방법을 포함하여 배아 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에서 지역 제한된 유전자 발현을 달성할 수 있도록 특별한 조치를 강조한다. C 분석나중 단계에서 시골 midbrain는 플라스미드 벡터 중재의 이득의 기능 및 midbrain 개발 손실의 기능 연구를위한 생체내 시스템에 탁월한를 제공합니다. 실험 시스템의 변경은 운명 매핑 분석을 수행과 유전자 발현의 규정을 조사하는 신경계의 다른 부분에 검정을 연장할 수 있습니다.
프로토콜
1. (없는 동영상)를 준비를 공급
- 1X PBS의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)의 신선한 1X 희석을 준비합니다. 더 이상 50 ML이 필요합니다. 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링합니다.
- 원하는 플라스미드 구조를 결합하여 사출 구조를 준비합니다. 우리는 ~ 10 μL의 최종 볼륨에 맞는 stoichiometry로 pCAG - 국기 벡터의 모든 구조를 넣어. 또한 pCAG-GFP 14 pCAG-mCherry는 추적 electroporation 효율과 electroporated 세포에 추가됩니다. 우리는이 실험 pCAG-mCherry을 사용합니다. 마지막으로, 태아의 여자는 midbrains로 주입 효율을 시각화하는 0.05 %의 최종 농도에서 플라스미드 DNA의 혼합물에 0.22 μm의 - 여과 빠른 그린 염료를 추가합니다.
2. 계란 준비 (비디오)
- HH 단계가 11 배아를 얻기 위해서는, 계란이 100에서 incubated해야 ° F (37.8 ° C) 25-40% 습도와 배입니다 41 시간 정도입니다. 장소그들의 측면에 계란 연필 대시로 각각의 상단을 표시합니다. 사전 예열, humidified 인큐베이터에서 트레이를 놓습니....
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토론
태아의 여자는 midbrain의 비켜 electroporation의는 낮은 비용과 midbrain dopaminergic 신경 세포 개발의 유전자 기능의 생체내 연구에서 수행하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 배아 midbrain 특정 DNA를 주입 함께 짧은 2mm에게 패 모양의 긴 백금 전극을 사용하면 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에 대한 관심의 유전자의 효율적인 표현을 달성하기위한 열쇠입니다. 또한, 올바른 HH 단계 11 여자의 배아를 사용하는 것이 중요합니다. 먼저 HH 단계 11 시에, 여자는 midbrain의 개발 forebrain, midbrain, 그리고 hindbrain가 morphologically 구별할 수있는 것으로 충분 같은 고급되어 있기 때문입니다. 이것은 주사 바늘과 전극 midbrain 지역에서, 따라서 효율적인 DNA를 주입하고 transfection의 정확한 위치를 얻을 수 있습니.......
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공개 사항
저자는 공개하지 잠재적인 충돌 관심이 없습니다.
감사의 글
우리는 pCAG-mCherry가 만들지 제공해 주셔서 박사 Takahiko 마츠다 감사드립니다. YCM은 Schweppe 재단의 경력 개발 대상과 관청 재단의 교부금에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 수정된 닭고기 달걀 | 찰스 리버 연구소 | ||
| 계란 인큐베이터 | GQF 제조 | 1502 운동가 | |
| BTX Electroporator | BTX 하버드 장치 | ECM830 | |
| 전극 | BTX 하버드 장치 | 45-0162 L-모양의 genetrodes | ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 |
| 플래티넘 이리듐 와이어 | 알파 Aesar | # 10056 | 0.5 밀리미터 직경 2mm 긴 전극을 만들기위한 |
| 유리 모세관 | 세계 정밀 악기 | TW100F-4 | |
| Microloader 피펫 팁 | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| 먹물 | 스테이플 | 사용하기 전에 20 %를 필터링 | |
| Microinjector | 파커 자동화, 파커 Hannifin 협력 | Picospritzer III | |
| 형광등 해부 현미경 | Leica | MZ16F | |
| Micropipette 풀러 | 셔터의 악기 | D-97 |
참고문헌
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci.
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재인쇄 및 허가
