의 정의 Aspergillus 니제르 형태론

요약

정확하게 생성하고 종합적으로 사상균의 형태와 성격 방법 Aspergillus 니제르는 형태학의 모양과 생산성의 수학적 상관 관계를 허용하는 설명되어 있습니다.

초록

사상균의 A. 니제르 음식에서 제약 산업에 대한 산업 공정의 넓은 범위에서 널리 사용되는 변형입니다. 이 filamentous 유기체의 가장 흥미로운 종종 지나치게 특성 중 하나는 복잡한 형태입니다. 그것은 울창한 구형 여럿 점성 mycelia (그림 1)의 범위. 다양한 공정 파라미터 및 재료 곰팡이 형태 ^1에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 최적의 생산성이 특정 형태학의 양식을 통해 강력하게 상호 있기 때문에, 곰팡이 형태는 종종 산업 생산에서 생산성의 병목 현상을 나타냅니다.

정확하게 형태학의 모양을 제어하는 직선 전달하고 우아한 접근은 증가 효소 생산 ^2-6에 기여 문화 매체에 대한 무기 불용성 마이크로 입자 (함수의 마그네슘 실리 케이트, 알루미늄 산화물이나 티타늄 실리 케이트 산화물 등)의 추가이다. obv가 있기 때문에마이크로 입자 의존 형태와 효소 생산 사이에 빚을내는 간 상관 관계는 수학적으로 생산성과 형태학의 모양을 연결하는 것이 바람직하다. 따라서 양적 정확하고 전체적인 형태학의 설명으로 타겟팅됩니다.

따라서, 우리는 생성 및 특성을 미세 입자 종속 형태학의 구조를 그리고 아마도 filamentous 미생물의 morphogenesis의 더 나은 이해에 기여 생산성 (그림 1)과 곰팡이 형태 신원을 확인하도록하는 방법을 제시한다.

재조합 변형 A. 니제르 SKAn1015는 탱크 생물 반응기를 흔들 3 패 72 H 위해 재배한다. G / L 이전에 접종 1 G / L, 3 G / L와 10의 농도의 활석 마이크로 입자 외에으로 형태학의 구조의 다양한 reproducibly 생성됩니다. 멸균 샘플은 생산 효소의 성장 진행 및 활동의 결정 24, 48, 72 시간 후에 촬영됩니다.형성된 제품은 높은 가치 효소 β-fructofuranosidase, 음식이나 타인 간의 포도당 ^7-9으로 자당의 반응을 catalyzes 제약 업계에서 네오 설탕 형성을위한 중요한 생체 촉매이다. 따라서 자당를 추가한 후 포도당의 양을 정함은 생산되는 β-fructofuranosidase의 양을 의미합니다. 포도당 부량는 96 - 웰 마이크로 titer 플레이트의 높은 처리량 분석을 위해 수정됩니다 갓 / POD-검정 ^10,에 의해 이루어집니다.

72시간 후 곰팡이 형태는 현미경으로 검사하고 디지털 이미지 분석이 특징입니다. 그럼으로써 Feret의 직경과 같은 곰팡이 매크로 형태, 예상 면적, 둘레, 순환성, 화면 비율, 진원도 숙녀 단합을위한 입자 형상 요소는 오픈 소스 영상 처리 프로그램 ImageJ로 계산됩니다. 관련 매개 변수의 종합적인 특성을 가능하게 무차 형태론 번호 (MN) ^11에 결합되어곰팡이 형태. 형태론 번호와 생산성의 긴밀한 상관 관계는 수학적 회귀으로 강조 표시됩니다.

프로토콜

1. 재배의 원자로 설치 및 시작

총 4 생물 반응기의 cultivati​​ons을 실시하고 있습니다.

1. A.의 재배를 위해 2.2 L의 작동 량과 함께 3 패 흔들 탱크 생물 반응기를 사용하여 니제르 SKAn1015.
2. 반응기에 72.6 g의 포도당 일수화물을 붓고 1.9 L 탈이온수로 가득 채웁니다.
3. 이러한 세 baffles 등 원자로 설비, 두 여섯 bladed 디스크 터빈 임펠러, 산도 전극, 공기 필터와 가스 유입구, 냉각 손가락, 공기 필터와 배기 공기 냉각기, 공기 필터 멸균 샘플링을위한 침지 튜브를 설치 중간, inoculum, 산성 및 기지 및 유입 호스.
4. 20 분 동안 121 ° C에서 반응을 압력솥.
5. 산성 - 기본 저수지 (2 M HCL, 2 M NaOH) 및 해당 펌프로 반응기를 연결하고 pH의 제어 유닛과 5.0의 산도 가치 ± 0.05을 설정합니다.
6. 냉각 수계로 반응기를 연결하고 가열 재킷 넣어원자로 용기 주변.
7. 대응하는 제어 장치와 온도 센서를 설치하고 37 온도를 설정 ± 0.1 ° C의 온도 제어 장치에서.
8. 반응기의 정상 교반 모터에 맞는 200 분 ^-1의 교반 속도로 서비스에 가져다.
9. 멸균 최소한의 성장 매체 ¹¹ 여물에게 멸균 입구 호스 (250 ML) 중 하나를 추가합니다. 매체 준비에 대한 모든 구성 요소는 20 분 동안 121 ° C에서 autoclaved 함께 섞여 있었다. 세 cultivations의 경우 구성 요소는 활석 1g / L의 농도에서 분말 (3MgO • 4SiO ₂ • H ₂ O) (반응 2), 3 G / L (반응 3)과 10 G / L을 (원자로 4) 등이 있습니다. 사용하기 전에는, 50 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (산도 6.5)에 마이크로 입자를 다시 중지되고 멸균 매체에 추가합니다. 제어 문화권에서는 (입자 제외) 50 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (산도 6.5)에 의해 마이크로 입자 현탁액을 대체합니다.
10. 포자 현탁액 (inoculum) 추가s은 Wucherpfennig 동부 표준시로 준비했습니다. 외 (2011) ¹¹ 그래서 여물 멸균 입구 호스 (50 ML) 중 하나에 해당 1X10 ⁶ ML ^-1 포자 금액의 농도. 접종은 재배의 시작 (H = 0 H)을 표시한다.
11. 1.0 L 분 ^-1의 속도와 폭기를 시작합니다.

2. 멸균 24 이후 샘플링, 48 및 육성 72 H

1. flacon 관에 멸균 문화 국물의 50 ML을 가져가라.
2. 바이오 매스 건조 중량, β-fructofuranosidase 활동 및 현미경 분석의 결정에 대한 샘플을 사용하십시오.

3. 24 이후 바이오 매스 건조 무게의 결정, 48 및 육성 72 H

1. 바이오 매스 샘플은 적어도 중복에 촬영 예정이다.
2. 무게 건조기에서 건조와 연결된 물 제트 진공 펌프와 Büchner 퍼널을에 필터를 삽입 후 마이크로 비늘로 셀룰로오스 필터.
3. 정의된 샘플 볼륨 (예 : 10 ml) 쇼핑을 필터링ND는 바이오 매스로부터 중간 화합물을 제거하는 데 10 ML 탈이온수로 필터를 린스.
4. 주름 필터를 한 가운데, 유리 페트리 접시에 넣고 및 체중 비극적 (최소 24 H)까지 구획 건조기에 넣어.
5. 건조기에서 필터를 냉정하고 무게를 측정합니다.
6. 로하고 사용하는 샘플 량으로 나누어 건조 바이오 매스없이 필터의 무게 차이로 바이오 매스 건조 중량을 계산합니다.

4. 24 이후에 하나님 / POD-수필에 의한 β-fructofuranosidase의 세포외 효소 활동의 결정, 48 및 육성 72 H

그들과 함께 일하면서 끊임없이 얼음에 샘플을 저장합니다.

1. 필터 1.5 ML 문화 서스펜션 트로프 반응 튜브에 필터를 통해 주사기로 문화 서스펜션을 눌러 셀룰로스 아세테이트 필터. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 반응 튜브를 저장합니다.
2. 반응 혼합물은 20을 사용하기 위해μL 시료와 포도당으로 자당의 반응을 촉진시키기 위해서 0.05 M 인산 완충액 (산도 5.4)에 용해 1.65 미터 자당 200 μL를 추가합니다. 적어도 반응이 나와 캐리가 중복.
3. 가열 블록에 20 분 동안 40 ° C에서 반응 혼합물을 품어. 가열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 잠복기에 의해 반응을 중지합니다. 얼음에 저장하여 반응 혼합물을 냉각 4시 10 분 ° C.에 대해 13.000 g에서 원심 분리기로 농축 물을 다운 스핀
4. 산도와 포도당으로 자당의 온도 의존 절단을 차지하고하려면 20 μL 탈이온수 대신에 20 μL 시료를 사용하여 빈 값을 수행.
5. 문화 국물에 잔류 포도당을 차지하고하려면 각 샘플에 대한 부정적인 제어를 수행. 이를 사용 20 샘플의 μL과 자당을 추가하고 같은 단계를 4.3에서 설명을 부화하기 전에 10 분 동안 95 ° C에서 가열에 의해 β-fructofuranosidase을 inactivate 위하여.
6. 그러한 그 샘플이 다음과 meas를 희석ured 흡착은 보정 값 범위에 있습니다.
7. 세중의 모든 효소 assays을 수행. 물론 마이크로 titer 접시에 2 μL 희석 샘플을 적용합니다. 대신 2 μL 시료의 10 개의 다른 체의 농도 (1 밀리미터에서 15 밀리미터까지)과 열 포도당 솔루션 2 μL를 사용하여 각함으로써 마이크로 titer 판에 대한 보정을위한 표준 범위를 적용합니다. 영점 교정은 2 μL 탈이온수 대신 2 μL 샘플을 사용하십시오.
8. 멀티 피펫을 사용하여 각 잘으로 시약 용액 200 μL를 추가합니다.
9. 상온에서 10 분 대한 혼합물을 품어.
10. 6 마이크로 titer 플레이트를 저장 ° 측정 (길어야 몇 시간)까지 C #.
11. 96 - 웰 선라이즈 마이크로 플레이트 리더와 마젤란 데이터 검색 소프트웨어를 사용하여 450 nm의에서 흡수를 측정합니다. 최대 5 초까지 혼합 시간을 설정합니다. 및 최대 1 초까지 나머지 기간.
12. 스프레드 시트로 결과 차트를 열고 표준 범위를 사용하여 교정 라인을 구축 :
    glucose 농도 = X + B 흡수
    
13. 활동을 계산 :
    활동 = (흡수는 X 희석 요인 - 빈 값) X + B
    
14. 샘플의 활동과 적절한 제외어 컨트롤의 차이를 계산하여 β-fructofuranosidase 활동을 알아내지 못했어요.
15. 계정 바이오 매스 건조 무게와 β-fructofuranosidase 활동 ¹¹ 고려하여 다음과 같은 사용에 대한 구체적인 생산성을 계산합니다.

5. 재배의 72 H 후 현미경 및 자동 이미지 분석

1. 장소 3시 경이 ML 문화 플라스틱 배양 접시에있는 서스펜션과형태학의 구조 분리 때까지 생리 나트륨 염화물 솔루션을 희석.
2. 통합 또는 연결된 카메라를 갖추고 현미경 페트리 접시를, ...을 놓다. 샘플 당 형태학의 구조의 약 100 이미지 (그림 2)를 습득하고 저장합니다. 각 이미지에 적어도 하나의 개체가 완벽하게 묘사하는 것을주의하십시오.
3. 영상 처리 프로그램 ImageJ ^12과 동일한 샘플의 모든 이미지를 엽니다. 프로세스 도구를 사용하여 흑백합니다 (그림 2) "바이너리 만들기"로 이미지를 변환합니다. 이미지의 전체 시리즈에 명령을 적용하기 위해 다음과 같이 매크로 코드를 사용합니다.
   실행 (, 바이너리 만들기 ")
   
4. 다시 ImageJ와 가공 바이너리 이미지를 엽니다. 도형 요소 Feret의 직경, 투영 면적, 둘레, 순환성, 화면 비율, 분석 도구 "세트 측정"와 모든 이미지에 대한 진원도 숙녀 단합을 계산합니다. 세리에 명령을 적용하기위한이미지 초밖에은 다음과 같이 매크로 코드를 사용합니다.
   ( "8 비트") 실행;
   ( "바이너리 만들기") 실행;
   ( "설정 규모 ...", "거리 = X 알려져 = 1000 픽셀 = 1 단위 = μm의 세계")를 실행;
   ( "세트 측정 ...", "지역 경계 형상 feret의 제한 표시 = 없음 진수 = 3를 리디렉션") 실행;
   ( "입자를 분석 ...", "크기 = 10,000 - 무한대의 순환성 = 0.00-1.00 쇼 = 디스플레이 개요") 실행;
   눈금 막대를 가로질러 직선을 구축하여 1000 μm의에 연결합니다 픽셀의 개수로서 X를 결정합니다. μm의의 눈금 막대의 길이 직선의 픽셀 수를 상관 관계.
5. 스프레드 시트에있는 각 이미지에 대한 형상 계수 값을 포함하는 결과 차트를 엽니다. 각 이미지에 대해 다음과 형태론 번호를 계산합니다.
   
6. 가치와 계정에 한 샘플의 모든 이미지 복용 형태론 번호에 대한 표준 편차 계산.
구체적인 생산성과 형태론 번호의 그래픽 상관 관계에 대한 그래프와 데이터 분석 프로그램을 사용하여 수학적 회귀하여 수학적 관계를 결정합니다.

6. 대표 결과

활석 마이크로 입자 대답 외에 통해 니제르 SKAn 1,015 형태는 진정한 펠렛의 형태에서 분산된 심지어 mycelial 형태로 변경됩니다. 펠렛의 형태는 표준 조건에서 전시되는 반면 mycelial 형태도 활석 마이크로 입자의 10 G / L (그림 4).와 매체의 보완으로 만들어집니다. 동시에 β-fructofuranosidase의 활동은 3 배 ^3-5 주위에 증가한다. 1 또는 3 G / 활석 가루의 L의 보완이 두 배 fructofuranosidase 활동 (그림 4.)으로 분산된 형태로 안내합니다.

마이크로 입자 부양 형태는 종합적 Mor로 표현할 수자동 이미지 분석에 의해 결정 매개 변수를 사용하여 계산할 수 phology 번호입니다. 동그란 부드러운 알약은 미세한 이미지에서 완벽한 동그라미로 표시됩니다. 이러한 입자 형태론 번호는 1 값을 갖습니다. mycelial 형태의 작은 조각은 0 형태론 번호를하였으며 한 차원 라인으로 단순화 할 수 있습니다. 길쭉한 불규칙 알약이나 대단히 짧은 시간과 같은 모든 중간 형태학의 양식에 따라서 0과 1 사이의 값을 가질 것이다. 비교적 큰 입자는 다소 낮은 형태론 번호 ^11의 큰 표면 또는 신장된 입자와 높은, 곰팡이 입자가 높아집니다.

표준 조건에서 반응기 1의 형태 전시물 0.8 주변 형태론 번호를. 10g / L 활석 가루와 원자로 4의 형태 0.1 주변 MN 있습니다. 1과 3g / L의 활석 분말 농도와 원자로 2, 3에 대한 형태론 번호는 분산된 모토를 보여주는 이러한 극단 사이에 놓여학문의 뜻. 마이크로 입자 종속 형태가 밀접 β-fructofuranosidase의 생산성과 관련이 있기 때문에, 그림 5와 비슷한 형태론 번호와 생산성 수학적 상관 관계가 얻어진다.

그림 1. 실험 설계 및 분석 절차의 전체 구조. A. 니제르는 72 H을위한 탱크 생물 반응기를 흔들 3 패에 (마이크로 입자와 함께 또는없이) 재배된다. 24 후 48 72헥타르 샘플은 다시 구체적인 생산성의 계산에 사용되는 바이오 매스 건조 무게와 β-fructofuranosidase 활동의 결정에 대해 영향력을 행사합니다. 48 H 후 곰팡이 형태는 현미경으로 검사하고 디지털 이미지 분석의 특징. 이미지 분석 관련 매개 변수는 수학 구체적인 생산성과 상호입니다 형태론 번호로 결합됩니다.

그림 2. A.에서 형태학의 구조를 현미경으로 생성된 이미지에 대한 이미지 처리의 단계 니제르. 1 단계 : 현미경에 의한 이미지 수집. 2 단계 : 이미지 개선에 필요한 경우. 3 단계 : 이미지 binarization, ImageJ에서 생성된 흑백 (이진) 이미지입니다. 4 단계 : 이진 이미지를 처리​​하고 불필요한 개체가 지워집니다. 5 단계 : 형태학의 분석은 오픈 소스 프로그램 ImageJ의 "입자 분석"기능과 함께 진행됩니다.

그림 3. A. 여러 형태학의 형태 부가 마이크로 입자의 농도에 의존 니제르. 마이크로 입자로 증가 농도는 펠렛의 크기가 정확하게 작은 코어 쉘 알약, 작은 양떼와도 자유롭게 분산 균사체로 감소 수 추가했습니다. 으로의 형태론 공학서브 머 지드 문화에 마이크로 입자 보완하여 pergillus 니제르 SKAn1015. 없이 microparticles (A), 10 MG / L (B), 0.1 g / L (C) 0.2 G / L (D), 0.3 g / L (E), 0.6 g / L (F), 1.0 g / L (G), 1.5 g / L (H), 2.0 g / L (I), 2.5 g / L (J), 3.0 g / L (K), 3.5 g / L (L), 4.0 g / L (M G / L (Q), 20 G / L (R), 30 G / L (S)과), 4.5 g / L (N), 5.0 g / L (O), 10 G / L (P), 15 40~50그램 / L (T). 이미지가 재배의 72 H 후 가벼운 현미경으로 찍은 것들.

그림 4.의 의존도에서 Fructofuranosidase 활동 활석 마이크로 입자 농도 1g / L (반응 2), 3 G / L (반응 3)과 10 G / L (원자로 4). 반응기 1은 마이크로 입자로 보충되지 않으며 현재 재배가 표준 조건 하에서 진행됩니다.

그림 5. 형태론 대표 좋은 상관 관계 (R ² = 0.91)숫자와 구체적인 생산성. 형태론 번호는 특정 생산성 (종좌표)에 대해 (가로 좌표)를 꾸몄다됩니다. 비선형 회귀는 기하 급수적인 상관 관계를 얻을.

토론

곰팡이 형태의 수정은 여러 수십 년 이래 생명 공학에 관심이있다. 다른 연구와 같은 산도 값, 전원 입력, 온도, 중간 영양분이나 inoculum 농도 ^일 선정 프로세스 매개 변수를 다양려고했는데, 반대로 형태의 다소 부정확할 및 불완전한 제어, 높은 에너지 비용, 억제 효과 또는 제품 불안정성에서 고생했습니다 마이크로 입자의 보완은 입자 크기와 농도의 미세 조정 변형을 통해 곰팡이 형태의 정밀한 엔지니어링이 가능합니다. 이것은 새로운 가능성을가 A와 biotechnological 생산 최적화 및 높은 생산 형태의 맞춤형 설계를위한 마이크로 입자를 사용하는 열립니다 니제르와 다른 filamentous 미생물.

디지털 이미지 분석은 곰팡이 매크로 형태를 특성화하기 쉽게 재현할 방법입니다. 그러나, 크기, 모양 및 표면 charac에 대한 매개 변수의 종류문학에서 설명한 형태학의 구조 ter가 복잡 곰팡이 형태의 신속한 평가를 만듭니다. 관련 매개 변수의 조합으로서 제시 형태론 번호,이 결핍을 방지하고 형태학의 구조의 포괄적인 특성화를 위해뿐만 아니라 생산성과 직접 수학적 상관 관계를위한뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 이것은 다시 가능한 필요한 프로세스에 주어진 형태이므로 형태의 정의에 의해 생산성 추정을 렌더링.

형태론 번호를 사용하면, 그것은 각종 펠렛과 덩어리의 morphologies ^4,5 구분할 수 있습니다. 형태론 번호의 앞으로의 개발을위한 프랙탈 차원의 배려가 유망한 것으로 보인다. 프랙탈 차원은 객체 ¹³ 속성을 채울 복잡 성과 질량 측정을 제공하므로 mycelial 형태의 전체적인 특성화를 위해 predestinated됩니다.

CRmycelial 성장 형태는 이전에 훨씬 더 문화 국물의 viscosities에게 ^2를 전시하기 위해 표시 되었기 때문에 높은 생산 mycelial 형태의 eation 그러나, 특히 대규모 재배의 공정 성능 문제로 이어질 수도 있습니다. 이것은 열 및 대량 전송 및 높은 전원 입력과 ^1을 작동 재배보다 비싼 확인을 필요로 활기가 아닌 혼합 지대의 형성에 문제가 발생합니다. 형태 변경 및 추가 모델에 통합되면 따라서 곰팡이 형태와 문화 국물의 점도의 관계가 고려되어야한다.