방법 논문

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

DOI:

10.3791/4032

⸱

2012년 8월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary

이 논문에서

요약

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이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

초록

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Neutrophils는 백혈구 중 가장 풍부한 타입입니다. 그들은 타고난 면역 시스템 1의 필수적인 부분을 형성합니다. 급성 염증 동안, neutrophils는 부상의 사이트로 마이 그 레이션하는 최초의 염증 세포가 있습니다. 전체 호중구의 세 번째 압연, 접착력과 윤회이고 두 번째는 microvascular 구조적 변화와 혈류에서 혈장 단백질 탈출, 부상 사이트에 neutrophils의 채용은 혈액 흐름을 증가 혈관이 먼저 팽창을 포함 stepwise 과정입니다 내피, 부상 2,3의 사이트에 neutrophils의 및 네 번째 축적. 생체내 및 시험 관내 방법의 다양한는 이러한 프로세스 4의 연구를 활성화하는 진화하고있다. 이 방법은 인간의 내피 세포에 걸쳐 호중구 윤회에 초점을 맞추고 있습니다.

호중구 윤회에 관련된 분자 프로세스를 검사 하나는 인기있는 방법은 인간의 N을 활용기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 5 상호 작용 eutrophils. 호중구 격리는 다른 여섯 시각적으로 설명하고, 따라서이 문서는 HUVEC의 격리를 위해 방법을 보여줍니다. 일단 격리와 합류로 성장, 내피 세포 부착 및 활성화 분자의 upregulation 결과적으로 활성화됩니다. 예를 들어, 증가 E-selectin 및 IL-8 표현 7의 TNF-α 결과 같은 크린 시토킨와 내피 세포의 활성화. E-selectin의 mediates neutrophils과 IL-8 mediates 활성화와 neutrophils의 확고한 유착의 캡처 및 압연. 유착 neutrophils은 윤회하다 후에. 윤회가 (내피 세포 자체를 통해) transcellularly paracellularly 발생 (내피 세포 분기점을 통해) 또는 수 있습니다. 대부분의 경우 이러한 상호 작용은 vasculature 7,8에서 발견 유동 조건에서 발생합니다.

병렬 플레이트 흐름 챔버는 널리 사용되는 시스템입니다 MI유체 전단은 생체내에서 발견하고 체외 9,10에서 유동 조건하에 호중구 채용의 학습을 가능하게합니다. 강조 마이크 몇몇 기업들은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 생성하고 각각 장점과 단점이 있습니다. 형광 이미징이 필요한 경우, 유리 또는 광학 유사한 폴리머가 사용해야합니다. 내피 세포는 유리에 잘 성장하지 않습니다.

여기 급속한 접착력과 인간 내피 세포의 성장을 지원하며 비교할 수있는 광학 자질이 있는지 폴리머로 만들어진 낮은 볼륨 ibidi 채널 슬라이드를 사용하여 호중구 윤회의 위상 대비, DIC 및 형광 이미징을위한 쉽고 빠른 방법을 제시 유리. 이 방법에서는 내피 세포 성장되었으며 ibidi의 μslide에 자극. Neutrophils는 유동 조건에서 소개되었으며 윤회가 평가되었다. 분기점의 형광 이미징은 대 paracellular의 범위에 실시간 결정을 활성화transcellular 윤회.

프로토콜

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1. 인간 혈관 내피 세포의 분리 및 유지 보수

  1. 인간의 혈액과 조직과 함께 작업할 때 수준 2 biosafety 절차를 사용해야합니다. 이용 가위는 태반에서 탯줄을 절단하고 긴밀하게 혈전 및 납품 중에 코드를 클램핑하여 발생한 손상에 대해서는 코드를 검사합니다. 잘라 및 코드의이 부분을 버리고.
  2. 50 MG의 collagenase를 포함 튜브로 따뜻한 코드 버퍼의 50 ML을하고 있는걸 1 밀리그램 / ML에서 신선한 collagenase 용액을 준비한다.
  3. 멸균 장갑으로 변경하고 소독 무딘 cannulas, 코드 클램프, 가위, 세 방식 중지 - 자지와 층류 후드에 거즈를 포함하는 autoclaved 악기 트레이를 엽니다.
  4. 두 동맥과 탯줄에있는 단일 정맥 선물을 식별합니다. 동맥은 소규모이며 정맥이 크고 cannulate하기 쉬운 반면, 꽉 죄이고 경향이 있습니다. 정맥에서 혈액을 플러시하려면 부드럽게에 연결된 양방향 꼭지로 정맥을 삽입 전위치에 단단히 붙잡아 정맥 주위에 클램프 정맥 및 장소 니면 한쪽 끝을. 정맥을 통해 코드 버퍼를 Perfuse. 을 통해 흐름이 명확해질 때까지 반복하고 코드의 끝을 클램프.
  5. 정맥에 Perfuse collagenase는 꼭지를 닫고 10 분 정도 따뜻한 코드 버퍼와....

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토론

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연구자는 정기적으로 호중구 모집하고 윤회를 공부하기 위해 다른 혈관 침대에서 내피 세포를 사용 하였다. 예는 있지만, 피부 microvascular 내피 세포 12, 인간 제대 정맥에서 10 간 sinusoidal 내피 세포를 13 내피 세포에 제한되지 않습니다. 그들 중에는 HUVEC 때문에 고립과 가용성 그들의 상대적 용이성의 넓은 인기를 얻었다. HUVEC은 생체내에서 발생하는 많은 내피 과정을 모방한 것이었 체외 모델 시스템에서 강력하다. 이 모델은 시스템. 많은 백혈구 하위 클래스와 이러한 프로세스를 규제하는 방법 중 활성화된 상세한 분석의 채용에 중요한 접착 분자 및 chemokines의 식별에 주었있다 HUVEC 함께 체외 작업에서는 궁극적으로 정보를 제공했고, 생체내 연구에 대한 기초를 형성 하였다 이해와 인간의 질병 14 치료.

본 논문에서는 e_con.......

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공개 사항

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

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그녀의 기술 지원 양 Lailey;과 인간의 탯줄 코드를 제공하는 캘거리, AB의 산기슭 병원의 단위 51 우리는 박사 피나 Colarusso 및 이미징 및 이미지 분석과 그들의 도움을 라이브 셀 이미징 시설 감사드립니다. 박사 KD 파텔은 앨버타 혁신이다 : 건강 솔루션 과학. 이 작품은 혁신과 앨버타 과학 연구 기관에 대한 캐나다 재단 보건 연구 장비 및 인프라 조성을위한 캐나다 연구소에서 운영 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 및 장비 회사 카탈로그 번호 댓글
Collagenase의 타입 1 워딩턴 4197
코드 버퍼 구성 : 산도 7.4에서 1mM 아뇨 2 PO 2분의 4 나 HPO 4 버퍼에 140 밀리미터 NaCl 4 MM KCl 10 밀리미터 D-글루코오스
내피 세포 미디어 (ECM) 페니실린의 100 단위 스트렙토 마이신의 100 μg 및 L-glutamine/ml의 0.3 밀리그램이 들어있는 16% 인간 혈청 보충 독수리 소금과 M199
M199 GIBCO 31100-035
페니실린의 스트렙토 마이신의 글루 탐 산염 (100X) Invitrogen 10378-016
Ibidi 챔버 Ibidi 80,606
TNF-α Prepro 테크 300 01A
인간 알부민 20 % 용액 제미 나이 Bioproducts 800,120,050
+ 및 MG 2 칼슘이없는 HBSS + 시그마 H2487-10X
칼슘 2 + 및 MG 2 HBSS + 시그마 H1387-10X

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-....

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태그

TNF

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