우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.
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이 논문에서
요약
초록
새로운 기능 뉴런이 constitutively 성인 포유류의 뇌의 제한된 영역에서 신경 줄기 세포의 내생 풀에서 생성을 나타내는 증거의 상당한 몸이있다. subventricular 영역 (SVZ)에서 신생아 neuroblasts는 후각 망울 (OB) 1에서의 최종 목적지까지의 뱃 부리 장식이있는 철새 스트림 (RMS)을 함께 마이그레이션. RMS에서 neuroblasts은 구조 지원 및 마이그레이션 4,5에 필요한 분자 요소의 소스로 혈관을 사용하여 astrocytic 프로세스 2,3에 의해 ensheathed 체인에 tangentially 마이그레이션. OB에서 neuroblasts는 체인에서 분리하고 interneurons로 차별화하고 기존의 네트워크 1, 6에 통합 다른 안구 레이어로 방사상으로 마이그레이션됩니다.
이 원고에서 우리는 쥐의 뇌의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션에 대한 절차를 설명합니다. 급성 조각의 사용은 assessm 수 있습니다밀접하게 생체 조건과 생체 이미징에 대해 액세스하기 어렵 뇌 영역에서에 유사한하는 microenvironment의 세포 마이그레이션 다닐. 또한, 결국 세포의 이주 속성을 변경할 수도 있습니다 organotypic과 셀 문화의 경우에서와 같이 긴 배양 조건을 방지합니다. 급성 조각의 Neuronal 전구체는 DIC 광학 또는 형광 단백질을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 야생 형 생쥐의 SVZ에 기자 마우스에서 neuroblasts을 접목하고, neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 사용하여 SVZ의 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨은 neuroblasts을 표시하고 이전에 따라에 대한 모든 적합한 방법입니다. 나중에 방법은 그러나, 개별 셀 때문에 분류 세포의 높은 밀도의 장기간 추적 할 수 없습니다. 우리는 비교적 빠른 수집 간격 (한 IMA 달성하기 위해 CCD 카메라가 장착 된 넓은 분야 형광 수직 현미경을 사용GE 매 15 또는 30 초)가 안정적으로 고정와 철새 단계를 식별합니다. 고정와 철새 단계 기간의 정확한 식별 결과의 모호 해석에 매우 중요합니다. 우리는 또한 3D로 neuroblasts 마이그레이션을 모니터링하기 위해 여러 Z 단계 인수를 수행. 폭 넓은 분야 형광 이미징은 neuronal 마이그레이션에게 7-10를 시각적으로 광범위하게 사용되어왔다. 여기, 우리는 neuroblasts 라벨을 성인 마우스 forebrain의 급성 조각에 neuroblast 이주의 실시간 비디오 영상을 수행하고, 세포 마이그레이션을 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜 성인 RMS의 neuroblasts의 마이그레이션을 예시 있지만, 또한 배아 및 조기 출생 후의 두뇌에 세포 이주를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. Neuronal 전구체를 라벨
Neuroblasts 선택적으로 stereotaxically SVZ 또는 RMS에 형광 단백질을 인코딩 바이러스 입자를 주입하여 (즉, DCX-GFP, Gad67-GFP) neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 마우스를 사용하여 보여 질, 또는 기자 마우스에서 neuronal 전구체를 접목하여 (즉, 수 야생 형 생쥐의 SVZ에 DCX-GFP, Gad67-GFP). 우리는 접목와 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨에 대한 절차를 설명합니다.
기자 마우스의 SVZ에서 neuroblasts의 분리
- 다음 솔루션은 neuroblast의 분리가 필요합니다.
40X 솔루션
10 ML 펜 / Strept (주식 펜 10,000 U / ML / Strept 1000 UG / ML)
10 ML 포도당 (주식 200 MG / ML)
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토론
적절한 뇌 지역에 neuronal 전구체의 올바른 타겟팅은 신경 회로의 적절한 조립과 기능의 근간이 기본 과정입니다. 세포의 대부분은 배아 발달 동안 마이그레이션 만 등의 OB, 이가있는 이랑과 소뇌 등의 몇 지역에서 출생 후의 두뇌에 neuronal 변위는 아직 이루어집니다. 출생 후의 뇌의 세포 마이그레이션을 꾸미고 메커니즘이 저조한 이해하지만, 남아 있습니다. 성숙한 신경 조직에 세포 마이그레이션 가이드에 관여하는 메커니즘와 분자 경로에 대한 지식은 출생 후의 뇌 neuronal 타겟팅에 대한 우리의 이해를 개선하고 뇌의 병에 걸린 영역으로 neuronal 채용을 유도 할 수있는 새로운 전략의 개발을위한 임상 관련성이있을 수 있습니다.
이 원고에서, 우리는 성인 마우스 forebrain의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성인 SVZ-OB를 사용하는 동안모델 시스템과 같은 경로는 동일한 기술은 배아와 초기 출생 후의 두뇌뿐만 아.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 부분적으로 Université 라발의 교제에 의해 지원되었다 ASJK에 건강 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. AS 출생 후의 neurogenesis에 캐나다 연구 의자의 수신자입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 자당 | 시그마 | S9378 | |
| 포도당 (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | 시그마 | S9625 | |
| KCI | 시그마 | P9541 | |
| MgCI이 x6H 2 O | 시그마 - 알드리치 | M2670 | |
| NaHCO 3 | 시그마 | S5761 | |
| 아뇨 2 PO 4 xH 2 O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI이 x2H 2 O | 시그마 - 알드리치 | C3881 | |
| Dextran은 TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| 포도당 (40X 솔루션) | 시그마 | G8769 | |
| 나트륨 pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | 시그마 | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | 시그마 | D-5025 | |
| 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal 매체 | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| 펜 / 패 혈성 | 생명 기술 | 15140-122 | |
| 케타민 / Xylazine | CDMV | 5230 | |
| 파스퇴르 피펫 | VWR | 14672-380 | |
| 15 ML 원뿔 관 | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ML 원뿔 관 | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 유리 모세관 (stereotaxic 분사) | WPI | 4878 | |
| 파라핀 유 | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| 상처의 봉합 | Stoelting | 50,487 | |
| Anafen | CDMV | 11,508 | |
| 20 CC의 주사기 | VWR | SS-20L2 | |
| 페트리 접시 | VWR | 25384-094 | |
| 한천 | Laboratoire 매트 | AP-0108 | |
| 아교 | Permabond | 910 | |
| 95% O 5분의 2 %의 CO 2 | Linde | 24068835 | |
| 블레이드 | WPI | 501901 | |
| 나일론 메쉬 | 워너 악기 | 64-0198 | |
| 원심 분리기 | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| 피펫 풀러 | 셔터 악기 | P-97 | |
| Nanoliter 주입기 | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic 주입 장치 | WPI | 502900 | |
| 마이크로 드릴 시스템 | WPI | 501819 | |
| Vibratome | 열 과학 | 920110 | |
| 폭 넓은 분야 형광 현미경 | 하늘 | BX61WIF | |
| CCD 카메라 | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| 울트라 조용한 이미징 챔버 | 하버드 장치 | 64-1487 | |
| PH-1시리즈 20 히터 플랫폼 | 하버드 장치 | 64-0284 | |
| 난방 시스템 | 워너 악기 | TC-344B | |
| 40X 물 침지 목표 | 하늘 | 1 UM587 | |
| 10X 물 침지 목표 | 하늘 | 1 UM583 | |
| 람다 DG-4 | 셔터 악기 | DG-4/OF | |
| MetaMorph 소프트웨어 | 분자 장치 | 40,000 | |
| Imaris 소프트웨어 | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
참고문헌
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. ....
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