인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

Summary

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H & E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H & E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H & E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

Abstract

섬 지역과 숫자, 성인 인간의 췌장의 내분비 세포 성분의 예측은 몇 십만에서 500에서 1,500 밀리그램 ^1-3으로 수백만 및 베타 질량 범위에 따라 다릅니다. 이 알려진 이질로 표준 처리 및 염색법 절차는 췌장 영역이 명확하게 정의되고 islets가 엄격한 조직 병리학 및 immunolocalization 시험을 사용하여 특징되었습니다 있도록 개발되었습니다.

장기 기증자에서 발견한 인간의 췌장을 처리를위한 표준화된 절차는이 시리즈의 파트 1에 설명되어 있습니다. 췌장은 가로 섹션 뒤에 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)로 처리됩니다. 췌장의 머리에서 가로축 부분이 더 나뉩니다 같은 크기에 따라 표시하고, 하위 섹션을 나타냅니다하기 가나다순으로 정리. 이러한 표준화가 이루어진 islets을 포함 uncinate 지역을 포함한 헤드 지역의 전체 교차 단면 분석을 위해 수주로 꼬리 지역에 췌장 폴리펩티드의 세포.

현재의 보고서는이 시리즈의 일부 2를 구성하고 섬 내분비 세포, 복제, 그리고 T 세포 infiltrates에 대한 강조와 함께 췌장 파라핀 섹션의 시리얼 sectioning 및 histopathological 특성화에 사용되는 절차를 설명합니다. 췌장 섹션의 병리는 두 exocrine, ductular 및 내분비 구성 요소를 특성화하기위한 것입니다. exocrine 구획은 특히 췌장 intraductal neoplasia ^4의 존재에 대한 관계에서, pancreatitis의 존재 (활성 또는 만성), 위축증, 섬유증, 그리고 지방뿐만 아니라 덕트 시스템에 대해 계산됩니다. Islets은 형태, 크기, 밀도, 내분비 세포, 염증, 섬유증, 아밀로이드, 그리고 H & E와 IHC 얼룩을 사용하여 복제 또는 apoptotic 세포의 존재를 평가하고 있습니다.

파트 2에서 설명한 마지막 구성 요소는 스테인드 슬라이드의 제공입니다디지털 전체 슬라이드 이미지로의. 디지털 슬라이드는 가상 biobank를 만들어 온라인 병리 데이터베이스의 경우, 췌장 영역으로 구성됩니다. 이 온라인 컬렉션에 대한 액세스는 현재 제 1 형 당뇨병 연구에 관련된 200 개 이상의 임상의와 과학자에게 제공됩니다. 온라인 데이터베이스는 파라핀 또는 냉동 시리얼 섹션에 대한 블록을 선택하는 신속하고 완벽한 데이터 공유 및 수사를위한 수단을 제공합니다.

Protocol

1. 흠없는 섹션에 대한 Microtomy

1. 표준 파라핀의 microtomy위한 한 물 목욕 및 마이크로톰를 설정합니다. 사건 번호, 췌장 영역 (샘플)과 슬라이드 번호를 긍정적으로 기소 슬라이드 미리 레이블을 사용합니다. 왼쪽에있는 카세트 레이블 마이크로톰 척의 장소 파라핀 블록.
2. 조직이 균일하게 발생 때까지 블록으로 정상 microtomy 절차, 섹션을 따릅니다. 시리얼 섹션 (두께 4 μm의, 초기 필수 얼룩의 수에 따라 3-6 (사례 제출 양식 부록 1 참조))의 리본을 생산하고 있습니다. 리본의 별도의 섹션, 연필로 번호가 매겨진 순서로 슬라이드에 순서대로 각 데리러, 장소. 섹션 정확한 순서 섹션 번호에 의해 사용되지 않는 경우 나타냅니다. 왼쪽으로 지향 슬라이드 레이블 카세트에서 발견으로 슬라이드에 동일한 방향을 유지합니다. 실온에서 하룻밤 건조 후 조사관에게 염색법 또는 배포와 함께 진행합니다.
3. 해상도실온 또는 -20 ° C.에 조직 및 아카이브를 보존하기 위해 파라핀의 얇은 레이어와 파라핀 블록의 표면 eal
4. 이후 microtomy 들어, 위와 같이 각 레벨에서 시리얼 부분에 대해 번호 유지합니다. 한 추가적인 슬라이드를 확보하고 각 블록 내의 각 ~ 100 μm의 수준을 위해 H & E 슬라이드로 얼룩.

2. H & E 염색법

1. autostainer의 첫 트레이에 다음 슬라이드 선반의 각 블록의 첫 번째 시리얼 sectioned 슬라이드를 놓습니다.
2. 표준 H & E 얼룩 프로그램을 선택하고 평소와 같이 진행합니다.
3. 염색법을 완료하면 coverslipping 위해 후드에 autostainer과 장소에서 슬라이드를 제거합니다.
4. 표준 기술을 사용 Coverslip. 인쇄된 라벨 (섹션 12 참조)과 함께 철저히 및 레이블 건조합니다.

3. IHC 설정

1. 이중 얼룩과 슬라이드의 입력 번호에 대한 Dako 프로그램을 선택합니다. TBST와 구연산 버퍼, 항체 및 기타 reag 준비지정된 볼륨 (표 1)에 따라 행군. 시약 트레이와 슬라이드를로드합니다. 깨끗하고 폐기물 라인의 회전은 제조 업체의 권장 사항에 따라 프로그램됩니다.
2. 수동 assays를 수행하는 경우 예상 볼륨을 준비합니다. 어느 단계에서 말리는 슬라이드를 피하기 위해 humidified 챔버에서 슬라이드를 품어. autostainer에 사용하면 각 시약에 대해 동일한 절차를 따르십시오.

4. IHC의 Deparaffinization 및 항원 불러오기

1. 5 분 크실렌에 슬라이드를 넣고. 한 번 반복합니다. 이것은 과도한 배경과 가난한 염색법을 초래하므로 표시된 때까지 슬라이드 후속 지점에서 밖으로 건조하도록 허용하지 마십시오.
2. 2 분 동안 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송합니다. 한 번 반복합니다.
3. 10 분 동안 메탄올의 신선한 3% H ₂ O _2에 슬라이드를 넣고.
4. 90 % 에탄올에서 그리고 물놀이 슬라이드는 3 분 동안 90 % 에탄올에 넣습니다.
5. 전송로 슬라이드1 분 70 %의 에탄올.
6. 드 이온화 물에 슬라이드를 씻어.
7. 예열 스티머 5 분간 기선의 구연산 완충액.
8. 30 분 증기선과 증기에 버퍼를 구연 산염하기 슬라이드를 추가합니다.
9. 즉시 물로 슬라이드를 전송하고 상온 (~ 20 분)까지 시원한 슬라이드 때까지 누르고 있습니다.
10. 시퀀스 (그림 1) 얼룩에 따라 Dako autostainer 랙에에 슬라이드를 전송하며 이중 염색법 프로그램을 실행합니다. autostainer 프로그램의 주요 단계는 수동 실행이 중복 수 있도록 나열됩니다.

5. 첫 차 항체 (KI-67, 인 경우에는 3 번 CD, 췌장 폴리펩티드)

1. 15 분 동안 스나이퍼 솔루션으로 슬라이드를 차단하십시오. TBST로 두 번 씻는다.
2. 30 분 동안 일차 항체의 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다.
3. 30m 위해 Mach2 염소 항 마우스 (KI-67) 또는 안티 - 토끼 (인 경우에는 3 번 CD, 폴리펩티드 췌장) 말과 무 퍼옥시데이즈 (HRP) 폴리머로 품어inutes. TBST로 두 번 씻는다.
4. 4 분간 슬라이드로 3,3-diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB)을 적용합니다. 물로 두 번 씻는다.
5. 폴리펩티드 췌장과 incubated 슬라이드가 동시에 assayed중인 Dako 개최되며 나머지 슬라이드는 일차 항체의 두 번째 세트 incubated하는 동안 모든 후속 단계에 사용 TBST. 또는 수동 assays 들어, 섹션 6으로 진행합니다.

6. 둘째 차 항체 (인슐린, 글루카곤)

1. 20 분 동안 DEEB에서 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다.
2. 20 분 TBST (인슐린) 또는 TBST에서 스나이퍼 (글루카곤)의 20 % 아비딘 차단에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단. TBST로 두 번 씻는다.
3. 15 분 동안 인슐린이나 글루카곤 일차 항체와 부화. TBST로 두 번 씻는다.
4. 인슐린 : 30 분 1:300 희석시 biotinylated 염소 안티 기니 돼지에서 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다. 표준했습니다 함께 알을 품다30 분 ctor ABC-AP 시약. TBST로 두 번 씻는다.
5. 글루카곤 : 30 분 동안 염소 항 마우스 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) 폴리머이어서 30 분 동안 버퍼에 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다.
6. 슬라이드가 conjugates에 incubated하는 동안 실온으로 LPR 버퍼를 따뜻하게. Dako 시약 선반에서 사용 장소 전에 즉각 세 ML 버퍼 당 액체 영구 레드 1 방울 (LPR)를 추가합니다. 4 분간 LPC에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻는다.
7. 1 분 hematoxylin에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어.
8. 1 분 TBS 산도 7.6에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어.
9. DAKO Autostainer에서 슬라이드를 언로 드합니다.
10. 즉시 폴리펩티드 췌장에 대해 묻다 슬라이드를 탈수. 모든 이중 스테인드 슬라이드 들어, 최소 1 시간 동안 건조한 후 탈수.

7. 탈수

1. 장소는 1 분 80 % 에탄올에 슬라이드.
2. 95 % 에탄올에 슬라이드를 찍어.
30 초 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드를 잡아.
3. 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송하고 1 분 누르고 있습니다. 반복합니다.
4. 크실렌의 딥 슬라이드.
5. 1 분 크실렌에 슬라이드를 잡아. 반복합니다.
6. 즉시 cytoseal를 사용하여 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다.

8. 슬라이드 레이블

1. 오르간과 블록 번호, 얼룩, 날짜 및 인쇄를 포함하여 케이스 식별 정보를 입력합니다. 시리얼 섹션 번호는 각 블록의 첫 번째 슬라이드 얼룩을위한 선택 사항입니다. 후속 수준은 번호로 표시됩니다.
2. 슬라이드에 레이블을 배치합니다.

9. 슬라이드 스캔

1. 스캐너 트레이에 스테인드 슬라이드를 삽입하고 장비에 따라 검사합니다.
2. 기증자와 조직 유형 (췌장의 머리, 몸, 꼬리, 비장)에 의해 슬라이드를 구성합니다.
3. -20 ° C에서 실내 온도와 나머지 흠없는 슬라이드에서 보관 스테인드 슬라이드가 사용까지.

10. Representative 결과

이러한 염색법 절차는 파라핀 및 신선한 냉동 블록의 기본적인 특성을 제공하는 당뇨병 (nPOD)과 췌장 장기 기증자에 대한 JDRF 네트워크를 위해 개발되었다. 각 기증자는 기본적인 특성을 가지고이 각각 췌장 영역에서 블록 (머리, 몸, 그리고 꼬리)와 비장 (그림 1도 사례 제출 양식 부록 1 참조)을 더럽히는 것 구성되어 수행했습니다. H & E 염색법은 전체에서 사용되는 임상 수준의 솔루션과 임상 시설에 관해서는 프로그래밍 autostainer를 사용하여 진행됩니다. 추가 공여 블록 sectioned있는 바와 같이, 각각의 조직 형태를 보여주 H & E를 위해 찍은 슬라이드를 가지고 있습니다. 블록이 다시 sectioned가되면, 조사관에게 배포으로 깊은 수준은 또한뿐만 아니라 각 수준에서 시리얼 부분을 번호로 전체 블록의 조직 형태를 문서화하는 대표적인 H & E 슬라이드에 대한 슬라이드를 촬영한 것입니다. 스테인드 슬라이드는으로 표시됩니다케이스 식별, 췌장 영역, 블록 번호, 얼룩 및 날짜 (그림 2)와 온라인 병리 정보 관리 시스템에 스캔. 제어 기증자의 대표 이미지는이 절차에 따라 예상되는 결과를 보여 낮은과 높은 배율 모두에서 그림 3에 표시됩니다. 검정 수동으로 수행하고 hematoxylin counterstain의 감소 더럽히는 것 강도를 보여줍와 폴리펩티드 췌장 (D, H)과 슬라이드 스테인드은 서로 다른 날짜에 assayed되었다. 일차 항체의 강도를 더럽히는 것의 차이 또는 assays 사이 counterstain 특히 개별적인 색상 보정이 동일한 셀 영역이나 카운트를 달성하도록 요구와 이미지 분석을 통해 별도로 슬라이드면 피해야하는 것입니다.

각 연구실은 많은 투 많은 편차 및 기타 시약 및 조건 염색법 강도와 특이성에 영향을 미칠 수 있으므로 항체 농도를 최적화 것으로 기대한다. 신규 정말이에요 취득과 함께신사는 염색법 절차 전 시약과 마찬가지로 얼룩 강도의 동일한 수준을 달성하는 것으로 알려져 긍정적이고 부정적인 컨트롤 샘플 확인하고 있습니다. nPOD 병리 코어에 최적화된 추가 항체는 참조 소스로 표 2에 제공되며 공촛점 현미경을위한 immunofluorescence assays를 multilabeling 사용되었습니다.

1 그림. Dako의 염색법의 격자.이 도식은 Dako의 autostainer에서 수행 nPOD 기증자 췌장에서 일상적인 분석을 묘사. nPOD 기증자는 4 자리 식별​​ 번호로 코딩하고 있습니다. 두 슬라이드 트레이는 얼룩 주최 슬라이드로 표시됩니다. 대체 슬라이드 구성은 기증자 슬라이드의 숫자에 따라 예상된다. 긍정적인 컨트롤은 두 개의 더블 얼룩 및 KI-67 인 경우에는 3 번 CD를위한 기증자 비장에 대한 알려진 긍정적인 기증자의 포함을 포함합니다. 음성 제어 이배가 두 SLI를 포함데스 인슐린과 글루카곤을위한 기증자 비장의 기본 항체 두 슬라이드의 호스트 종에서 면역 글로불린 (IG)와 incubated 한 사람 거였어요의 췌장 블록에서.

그림 2. 디지털 스캔 작업이 수행되기 전에 대표적인 두 스테인드 슬라이드. 전형적인 완성된 슬라이드는 슬라이드 라벨링 매개 변수와 조직 배치와 함께 표시됩니다.

그림 3. 대표 H & E와 췌장 섹션에 IHC 얼룩. 성인 여성의 장기 기증 (6096-04 팬헤드야)의 췌장에서 구간은 스테인드와 같은 프로토콜에 설명된 실시 디지털 스캔했다. 이미지가 전체 섹션 (AD)의 한 섬 (EH)에서 ImageScope 보는 프로그램을 사용하여 획득했다. 인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드에 대한 예상 섬 얼룩 농도입니다이 췌장 헤드 블록은 모든 islets은 주로 췌장 폴리펩티드-긍정 세포를 포함하는으로 uncinate 지역이나 복부 췌장 엽의 일부가 포함된 섹션 차원 delineates로 섹션 BD에 대해 관찰했다. hematoxylin는 B와 C의 농도가 최적입니다 counterstain 동안 패널 D에서 hematoxylin counterstain가 너무 가벼운 것이 있습니다. EH 패널은 β-세포와 α-세포 예상 분포와 지느러미 엽의 섬을 보여줍니다. 몇 췌장 폴리펩티드 세포 섬 (H)의 왼쪽 하단 부분에서 발견된다. , E-H &E; B, F-Ki67 + 인슐린, C, G-인 경우에는 3 번 CD + 글루카곤, D, H, 췌장 폴리펩티드. 광고, 0.2x, EH-12.8x.

Discussion

시간의 경과에 슬라이드 다수에 걸쳐 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 특히 때 IHC 절차의 표준화, 이미지 분석을 위해 중요합니다. 이 보고서에 설명된 IHC 염색법의 절차는 8 시간 노동 일 이내 autostainer를 사용하여 주어진 기증자의 샘플 배치 분석을 허용할 것이며, 이전의보고 ^5에서 수정됩니다. 각 스테인드 슬라이드 디지털 전체 슬라이드 이미지가 웹 기반의 온라인 병리 시스템을 통해 nPOD - 제휴 조사관에게 제공했다. 수사 당국은 슬라이드와 함께 기증자 인구 통계, 실험실 데이터 및 기타 관련 임상 기록을 검토하고 (참조 학업을위한 블록이 가장 적합한 선택하실 수 있습니다 수 http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php을 자세한 정보) . 이러한 온라인 병리 시스템은 "가상 biobank"로 제공합니다. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30 % 과산화수소 (H 2 O 2)	FisherScientific	H325-500	내생 퍼옥시데이즈 차단
ABC-알칼리 인산 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스)	벡터	AK-5000	AP 켤레축
항체 희석액	Invitrogen	003,218	일차 항체
아비딘 차단기	벡터	SP-2001	내생 비오틴 차단
Biotinylated 염소 안티 기니 돼지	벡터	BA-7000	이차 항체
시약을 청소법	FisherScientific	7301	Leica autostaineR
구연산 버퍼, 산도 6.0	BioGenex	HK086-9K	항원 검색
Clarifier 일	FisherScientific	7401	Leica autostainer
Cytoseal XYL	FisherScientific	8312-4	Coverslip mountant
DAB	벡터	SK-4100	HRP chromogen
DEEB	DAKO	S2003	내생 AP는 시약을 차단
알콜 Eosin Y	FisherScientific	71,204	Leica autostainer
Ethanols-백퍼센트 95 % 90 % 70 %	FisherScientific	여러	Deparaffinization 및 coverslipping
Hematoxylin	DAKO	S3301	Dako autostainer
Hematoxylin 7211	FisherScientific	7211	Leica autostainer
IgG (일차 항체에 대한 모든 호스트 종)	여러	여러	예비 선거에 대한 부정적인 컨트롤
액체 영구 레드 (LPR)	DAKO	K0640	AP chromogen
Mach2 AP	Biocare 의료	MALP521L	염소 항 마우스 AP 켤레축
Mach2 HRP	Biocare 의료	MHRP520L	염소 항 마우스 HRP 켤레축
Mach2 HRP	Biocare 의료	RHRP520L	염소 항 마우스 HRP 켤레축
메탄올	FisherScientific	여러	H 2 O 2 희석제
정상 염소 혈청	벡터	S-1000	IHC 차단 시약
저격병	Biocare 의료	BS966M	IHC 차단 시약
TBST 20X	ThermoScientific	TA-999-TT	IHC 버퍼
Triology 20x	세포 나포	920P-06	항원 불러오기
크실렌	FisherScientific	여러	Deparaffinization 및 coverslipping

일차 항체	호스트 종	공급 업체	고양이. #	코멘트와 항원 불러오기
파라핀
아밀라아제	마우스	산타 크루즈	SC-46657	구연 산염
Amylin	마우스	Serotec	MCA11267	구연 산염
탄소 anhydrase 19.9	마우스	Abcam	ab15146
Caspase-3, 죽습	토끼	세포 시그널링	9961	구연산 또는 부작
CD20	마우스	DAKO	M0755	구연산 또는 부작
인 경우에는 3 번 CD	토끼	DAKO	A0452	구연 산염
CD34	마우스	세포 시그널링	3569	구연 산염
CD4	마우스	DAKO	M7310	구연 산염
CD45	마우스	DAKO	M0754	구연 산염
CD68	마우스	DAKO	M0876	구연 산염
CD8	마우스	DAKO	M7103	구연 산염
를 Chromogranin	토끼	DAKO	A0430	구연 산염
CK17	마우스	DAKO	M7046	구연 산염
CK19	마우스	DAKO	M0772	구연 산염
CK7	마우스	DAKO	M7018	구연 산염
C-펩타이드	토끼	세포 시그널링	4593	구연 산염
Foxp3	쥐	전자 Bioscience	14-4776-80	구연 산염
Ghrelin	염소	산타 크루즈	SC-10386
Ghrelin	토끼	Abcam	ab85104
글루카곤	토끼	DAKO	A0565
글루카곤	마우스	Abcam	ab10988	구연 산염
글루카곤	기니피그	Bachem	T-5037	구연 산염
GLUT-1	마우스	Abcam	ab40084	삼부작
GLUT-2	토끼	산타 크루즈	SC-9117	인간 islets로 표현되지 않음
인슐린	기니피그	DAKO	A0564
KI-67	마우스	DAKO	M7240	구연 산염
Mafa	토끼	Novus 생물	NB400-137A	삼부작
폴리펩티드 췌장	토끼	Invitrogen	18-0043	구연 산염
Pdx-1	기니피그	Abcam	ab47308	구연산 또는 부작
Proinsulin	마우스	Novocastra	NCL-proin-1G4
Proinsulin	마우스	발달 연구 하이 브리 도마 은행	GS-9A8	구연 산염
Secretagogin	토끼	시그마	고전력 증폭기 006,641	구연 산염
부드러운 근육 actin	토끼	Abcam	ab5694
Somatostatin	토끼	DAKO	A0566
Synaptophysin	마우스	DAKO	M0776	구연 산염
냉동 신선한	호스트 종	공급 업체	고양이. #	댓글
CD11b	쥐	Abcam	ab6332	4 % PF으로 수정
CD11c	토끼	Serotec	AHP1226
CD25	마우스	Novus 생물	NB 600-564	파라핀 섹션에 대한 하룻밤 배양을 사용하여
CD94	마우스	Abcam	ab61874	아세톤으로 고정
GAD65	마우스	산타 크루즈	SC-130569	4 % PF으로 수정
HLA-ABC	마우스	DAKO	M0736	아세톤 또는 4 %의 PF으로 수정

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Aperio Scanscope CS	Aperio		디지털 슬라이드 스캐너
DAKO Autostainer 플러스	DAKO		IHC의 얼룩
라벨 매트릭스 인쇄 소프트웨어	BioCarta	LM7UP57	슬라이드 레이블 소프트웨어
Leica XL Autostainer	Leica		H & E 얼룩
프리미엄 Coverglass	FisherScientific	12-548-5J	Coverslip
스펙트럼 정보 관리자	Aperio		스캐너 소프트웨어
Superfrost 플러스 슬라이드	FisherScientific	12-550-15	적극적으로 청구 슬라이드
야채 기선	검정과 데커	여러	항원 검색
얼룩말 TLP 3742	CDWG	TLP3742	슬라이드 라벨 ​​프린터