이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H & E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H & E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H & E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
섬 지역과 숫자, 성인 인간의 췌장의 내분비 세포 성분의 예측은 몇 십만에서 500에서 1,500 밀리그램 1-3으로 수백만 및 베타 질량 범위에 따라 다릅니다. 이 알려진 이질로 표준 처리 및 염색법 절차는 췌장 영역이 명확하게 정의되고 islets가 엄격한 조직 병리학 및 immunolocalization 시험을 사용하여 특징되었습니다 있도록 개발되었습니다.
장기 기증자에서 발견한 인간의 췌장을 처리를위한 표준화된 절차는이 시리즈의 파트 1에 설명되어 있습니다. 췌장은 가로 섹션 뒤에 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)로 처리됩니다. 췌장의 머리에서 가로축 부분이 더 나뉩니다 같은 크기에 따라 표시하고, 하위 섹션을 나타냅니다하기 가나다순으로 정리. 이러한 표준화가 이루어진 islets을 포함 uncinate 지역을 포함한 헤드 지역의 전체 교차 단면 분석을 위해 수주로 꼬리 지역에 췌장 폴리펩티드의 세포.
현재의 보고서는이 시리즈의 일부 2를 구성하고 섬 내분비 세포, 복제, 그리고 T 세포 infiltrates에 대한 강조와 함께 췌장 파라핀 섹션의 시리얼 sectioning 및 histopathological 특성화에 사용되는 절차를 설명합니다. 췌장 섹션의 병리는 두 exocrine, ductular 및 내분비 구성 요소를 특성화하기위한 것입니다. exocrine 구획은 특히 췌장 intraductal neoplasia 4의 존재에 대한 관계에서, pancreatitis의 존재 (활성 또는 만성), 위축증, 섬유증, 그리고 지방뿐만 아니라 덕트 시스템에 대해 계산됩니다. Islets은 형태, 크기, 밀도, 내분비 세포, 염증, 섬유증, 아밀로이드, 그리고 H & E와 IHC 얼룩을 사용하여 복제 또는 apoptotic 세포의 존재를 평가하고 있습니다.
파트 2에서 설명한 마지막 구성 요소는 스테인드 슬라이드의 제공입니다디지털 전체 슬라이드 이미지로의. 디지털 슬라이드는 가상 biobank를 만들어 온라인 병리 데이터베이스의 경우, 췌장 영역으로 구성됩니다. 이 온라인 컬렉션에 대한 액세스는 현재 제 1 형 당뇨병 연구에 관련된 200 개 이상의 임상의와 과학자에게 제공됩니다. 온라인 데이터베이스는 파라핀 또는 냉동 시리얼 섹션에 대한 블록을 선택하는 신속하고 완벽한 데이터 공유 및 수사를위한 수단을 제공합니다.
프로토콜
1. 흠없는 섹션에 대한 Microtomy
- 표준 파라핀의 microtomy위한 한 물 목욕 및 마이크로톰를 설정합니다. 사건 번호, 췌장 영역 (샘플)과 슬라이드 번호를 긍정적으로 기소 슬라이드 미리 레이블을 사용합니다. 왼쪽에있는 카세트 레이블 마이크로톰 척의 장소 파라핀 블록.
- 조직이 균일하게 발생 때까지 블록으로 정상 microtomy 절차, 섹션을 따릅니다. 시리얼 섹션 (두께 4 μm의, 초기 필수 얼룩의 수에 따라 3-6 (사례 제출 양식 부록 1 참조))의 리본을 생산하고 있습니다. 리본의 별도의 섹션, 연필로 번호가 매겨진 순서로 슬라이드에 순서대로 각 데리러, 장소. 섹션 정확한 순서 섹션 번호에 의해 사용되지 않는 경우 나타냅니다. 왼쪽으로 지향 슬라이드 레이블 카세트에서 발견으로 슬라이드에 동일한 방향을 유지합니다. 실온에서 하룻밤 건조 후 조사관에게 염색법 또는 배포와 함께 진행합니다.
- 해상도실온 또는 -20 ° C.에 조직 및 아카이브를 보존하기 위해 파라핀의 얇은 레이어와 파라핀 블록의 표면 eal
- 이후 microtomy 들어, 위와 같이 각 레벨에서 시리얼 부분에 대해 번호 유지합니다. 한 추가적인 슬라이드를 확보하고 각 블록 내의 각 ~ 100 μm의 수준을 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
시간의 경과에 슬라이드 다수에 걸쳐 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 특히 때 IHC 절차의 표준화, 이미지 분석을 위해 중요합니다. 이 보고서에 설명된 IHC 염색법의 절차는 8 시간 노동 일 이내 autostainer를 사용하여 주어진 기증자의 샘플 배치 분석을 허용할 것이며, 이전의보고 5에서 수정됩니다. 각 스테인드 슬라이드 디지털 전체 슬라이드 이미지가 웹 기반의 온라인 병리 시스템을 통해 nPOD - 제휴 조사관에게 제공했다. 수사 당국은 슬라이드와 함께 기증자 인구 통계, 실험실 데이터 및 기타 관련 임상 기록을 검토하고 (참조 학업을위한 블록이 가장 적합한 선택하실 수 있습니다 수 http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php을 자세한 정보) . 이러한 온라인 병리 시스템은 "가상 biobank"로 제공합니다. .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 기증자의 가족과 전문가의 도움이 연구와 에밀리 몽고메리, 로버트 Pietras, 앤 푸, Mitali Agarwal, 그리고 Roshan Agarwal에 관련된 장기 조달 기관 감사드립니다. 이 작품은 당뇨병과 췌장 장기 기증자를위한 네트워크를 지원 소아 당뇨병 연구 재단 (MC-T.)에 의해 재정 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 30 % 과산화수소 (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | 내생 퍼옥시데이즈 차단 |
| ABC-알칼리 인산 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) | 벡터 | AK-5000 | AP 켤레축 |
| 항체 희석액 | Invitrogen | 003,218 | 일차 항체 |
| 아비딘 차단기 | 벡터 | SP-2001 | 내생 비오틴 차단 |
| Biotinylated 염소 안티 기니 돼지 | 벡터 | BA-7000 | 이차 항체 |
| 시약을 청소법 | FisherScientific | 7301 | Leica autostaineR |
| 구연산 버퍼, 산도 6.0 | BioGenex | HK086-9K | 항원 검색 |
| Clarifier 일 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | 벡터 | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | 내생 AP는 시약을 차단 |
| 알콜 Eosin Y | FisherScientific | 71,204 | Leica autostainer |
| Ethanols-백퍼센트 95 % 90 % 70 % | FisherScientific | 여러 | Deparaffinization 및 coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (일차 항체에 대한 모든 호스트 종) | 여러 | 여러 | 예비 선거에 대한 부정적인 컨트롤 |
| 액체 영구 레드 (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare 의료 | MALP521L | 염소 항 마우스 AP 켤레축 |
| Mach2 HRP | Biocare 의료 | MHRP520L | 염소 항 마우스 HRP 켤레축 |
| Mach2 HRP | Biocare 의료 | RHRP520L | 염소 항 마우스 HRP 켤레축 |
| 메탄올 | FisherScientific | 여러 | H 2 O 2 희석제 |
| 정상 염소 혈청 | 벡터 | S-1000 | IHC 차단 시약 |
| 저격병 | Biocare 의료 | BS966M | IHC 차단 시약 |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC 버퍼 |
| Triology 20x | 세포 나포 | 920P-06 | 항원 불러오기 |
| 크실렌 | FisherScientific | 여러 | Deparaffinization 및 coverslipping |
표 1. 특정 시약.
| 일차 항체 | 호스트 종 | 공급 업체 | 고양이. # | 코멘트와 항원 불러오기 |
|---|---|---|---|---|
| 파라핀 | ||||
| 아밀라아제 | 마우스 | 산타 크루즈 | SC-46657 | 구연 산염 |
| Amylin | 마우스 | Serotec | MCA11267 | 구연 산염 |
| 탄소 anhydrase 19.9 | 마우스 | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, 죽습 | 토끼 | 세포 시그널링 | 9961 | 구연산 또는 부작 |
| CD20 | 마우스 | DAKO | M0755 | 구연산 또는 부작 |
| 인 경우에는 3 번 CD | 토끼 | DAKO | A0452 | 구연 산염 |
| CD34 | 마우스 | 세포 시그널링 | 3569 | 구연 산염 |
| CD4 | 마우스 | DAKO | M7310 | 구연 산염 |
| CD45 | 마우스 | DAKO | M0754 | 구연 산염 |
| CD68 | 마우스 | DAKO | M0876 | 구연 산염 |
| CD8 | 마우스 | DAKO | M7103 | 구연 산염 |
| 를 Chromogranin | 토끼 | DAKO | A0430 | 구연 산염 |
| CK17 | 마우스 | DAKO | M7046 | 구연 산염 |
| CK19 | 마우스 | DAKO | M0772 | 구연 산염 |
| CK7 | 마우스 | DAKO | M7018 | 구연 산염 |
| C-펩타이드 | 토끼 | 세포 시그널링 | 4593 | 구연 산염 |
| Foxp3 | 쥐 | 전자 Bioscience | 14-4776-80 | 구연 산염 |
| Ghrelin | 염소 | 산타 크루즈 | SC-10386 | |
| Ghrelin | 토끼 | Abcam | ab85104 | |
| 글루카곤 | 토끼 | DAKO | A0565 | |
| 글루카곤 | 마우스 | Abcam | ab10988 | 구연 산염 |
| 글루카곤 | 기니피그 | Bachem | T-5037 | 구연 산염 |
| GLUT-1 | 마우스 | Abcam | ab40084 | 삼부작 |
| GLUT-2 | 토끼 | 산타 크루즈 | SC-9117 | 인간 islets로 표현되지 않음 |
| 인슐린 | 기니피그 | DAKO | A0564 | |
| KI-67 | 마우스 | DAKO | M7240 | 구연 산염 |
| Mafa | 토끼 | Novus 생물 | NB400-137A | 삼부작 |
| 폴리펩티드 췌장 | 토끼 | Invitrogen | 18-0043 | 구연 산염 |
| Pdx-1 | 기니피그 | Abcam | ab47308 | 구연산 또는 부작 |
| Proinsulin | 마우스 | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | 마우스 | 발달 연구 하이 브리 도마 은행 | GS-9A8 | 구연 산염 |
| Secretagogin | 토끼 | 시그마 | 고전력 증폭기 006,641 | 구연 산염 |
| 부드러운 근육 actin | 토끼 | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | 토끼 | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | 마우스 | DAKO | M0776 | 구연 산염 |
| 냉동 신선한 | 호스트 종 | 공급 업체 | 고양이. # | 댓글 |
| CD11b | 쥐 | Abcam | ab6332 | 4 % PF으로 수정 |
| CD11c | 토끼 | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | 마우스 | Novus 생물 | NB 600-564 | 파라핀 섹션에 대한 하룻밤 배양을 사용하여 |
| CD94 | 마우스 | Abcam | ab61874 | 아세톤으로 고정 |
| GAD65 | 마우스 | 산타 크루즈 | SC-130569 | 4 % PF으로 수정 |
| HLA-ABC | 마우스 | DAKO | M0736 | 아세톤 또는 4 %의 PF으로 수정 |
표 2. 일차 항체.
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Aperio Scanscope CS | Aperio | 디지털 슬라이드 스캐너 | |
| DAKO Autostainer 플러스 | DAKO | IHC의 얼룩 | |
| 라벨 매트릭스 인쇄 소프트웨어 | BioCarta | LM7UP57 | 슬라이드 레이블 소프트웨어 |
| Leica XL Autostainer | Leica | H & E 얼룩 | |
| 프리미엄 Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| 스펙트럼 정보 관리자 | Aperio | 스캐너 소프트웨어 | |
| Superfrost 플러스 슬라이드 | FisherScientific | 12-550-15 | 적극적으로 청구 슬라이드 |
| 야채 기선 | 검정과 데커 | 여러 | 항원 검색 |
| 얼룩말 TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | 슬라이드 라벨 프린터 |
표 3. 특정 물품 및 장비.
참고문헌
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
