형광성의 현장에서 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다 VAR multigene 가정에서 Plasmodium falciparum 감염된 적혈구 1. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다.
haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE 1.
여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA - 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 2 (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 - 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성
PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 1 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다.
1 일
- P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800 XG에서 원심 분리하여 2~5% 늦게 무대 IE를 포함.
- 37 2 ML에서 피 펠렛를 다시 일시 중지 ° C 따뜻한 0.75 % 젤라틴 14 ML 멸균 튜브에 솔루션 및 침전에 감염되지 않은 및 링 단계 IE를 허용하도록 37 ° C 15-20 분에 출발합니다.
- 말기 IE를 수확, 새로운 14 ML 튜브로, 위의 단계를 즉 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어.
- 특정 항 PfEMP의 50 μl를 희석37의 2 ML ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어와 살균 필터 1 항체.
- 37 번 30 분에 14 ML 멸균 튜브와 배양에서 살....
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결과
그림 1은 주요 단계와 RNA 물고기 방법론의 시간 기간의 순서도를 보여줍니다.
단일 P.를 사용하여 잘하고 제대로 보존 스테인드 mRNA 생선 실험을 대표하는 일련의 이미지 falciparum IE는 그림 2에 표시됩니다. 이 세포 protozoan는 DAPI와 푸른 물들어있는 작은 (1-1.5 μm 직경) 핵이 있습니다. 배란 후 24 시간 P.의 적혈구 침공 후 falciparum은 schizogony, 즉 핵분열의 과정이 시작됩니다. VAR 유전자 전사의 최적 생선 검색이 48 시간 간 erythrocytic lytic주기를 10-22 주위에 시간에 발생합니다. 프로브는 일반적으로 아마도 핵 봉투 - 관련 endoplasmic 소포체 무엇에, 주요 핵 몸 옆에 표시 종을 mRNA에 잡종을 만들다. 행에서 좋은 품질.......
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토론
RNA 물고기 분석 등 북부 blotting과 RT-PCR 등의 방법에 대조적으로, 단일 세포 수준에서 특정 mRNA의 성적 차별을 할 수 있습니다. 이 P.,이 예에서는이 가능 transcriptionally 운영 중 및 운영 중지 세포 구별 할 수 있습니다 falciparum은 기생 인간의 적혈구 내부 원생 동물. 이러한 모든 세포 관찰은 종종 필요하고 중요하고 새로운 전사 패턴에게 1 낼 수 있습니다.
다른 RNA 물고기 방법은 4-10에 설명 된 있지만, P.의 동시 VAR mRNA 전사의 연구에 대한 새로운 세련된 프로토콜의 개발을위한 필요가있다 falciparum. 검색 도구로 asRNA 프로브를 사용하여 mRNA 활동의 특별한 시간적 패턴은 쉽게 셀에 지역화 할 수 있습니다. 또한, asRNA 프로브들은 구체적인 일을 지원하는.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 우수한 기술 지원을 위해 기생충과 크리스티나 Holm이의 genotyping을 위해 마이클 Alifrangis과 Ulla Abildtrup 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (보조금 55,005,511), Lundbeck 재단 (부여 R9-A840)와 닐스 Bohr 국제 교류 재단이 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| Albumax 미디어 : Gentamycin 황산염 Albumax - 솔루션 | Lonza | BE02-012E | 2.5 ML gentamycin 황산염 50 ML Albumax - 솔루션 |
| Albumax - 솔루션 : 하이포 잔틴 | 시그마 - 알드리치 | H9377 | 0,8 g 하이포 잔틴 |
| Albumax - 솔루션 : AlbuMAX II | 나는nvitrogen | 11021-037 | 200g Albumax |
| Albumax - 솔루션 : RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4리터 RPMI 1640 최대의 자석과 디졸브. 50 ° C. 필터 살균 및 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. |
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참고문헌
- Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).
- Pinaud, R., M....
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