비켜 electroporation의 여자는 조류 배아의 유전자 조작을 허용하는 기법입니다. 이 기법의 일반적인 응용 프로그램은 유전자와 putative 향상제 요소의 기능 분석을 포함합니다. 이 동영상은 HH 10 여자는 배아에서 신경 튜브 electroporation을 보여줍니다. 사출 기술과 적절한 계란 처리는 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대형 크기와 닭 배아의 외부 개발 오래 발달 생물학 연구에 가치있는 도구가 만들었습니다. 분자 생물 학적 기법의 도래와 함께, 여자가 유전자 조절과 기능을 연구하는 유용한 시스템이되고있다. 개발 닭 배아에 DNA 또는 RNA 구조를 electroporating함으로써, 유전자는 명시적 또는 생체내 유전자 기능의 분석을 위해 무너뜨렸다 수 있습니다. 마찬가지로 기자의 구성은 운명 매핑에 사용할 수 또는 putative 유전자 규제 요소를 검사합니다. 마우스에서 유사한 실험에 비해, 여자의 electroporation은 빠르고 쉽고 저렴한되는 장점이 있습니다. 이 비디오는 배아를 조작하기 위해 달걀 껍질에 창문을 만드는 방법 첫째 보여줍니다. 다음, 난자는 배아 아래 주입 인도 잉크의 희석 용액과 시각이다. 유리 바늘과 피펫은 개발 신경 튜브 다음, 백금 전극이 배아로 병렬 배치하고 짧은 전기 펄스가 펄스 발생기와 함께 관리되는에 DNA와 빠른 그린 염료를 주입하는 데 사용됩니다. 마지막으로 계란은 테이프로 밀봉하고 발전을위한 인큐베이터에 다시 배치. 또한, 비디오 적절한 계란 보관 및 처리를 보여줍 배아 손실 다음의 electroporation의 가능한 원인에 대해 설명합니다.
프로토콜
에그 처리
- 계란이 생존에 상당한 손실 (작은 와인 쿨러는 이러한 용도에 이상적입니다)없이 부화하기 전에 최대 1 주일 13 ° C에 보관 수 있습니다.
- 이전 부화하기 위해 달걀이 인큐베이터는 37.8로 설정 humidified 닭고기에 다음 상온, 장소에 따뜻한 있도록 ° C (100 ° F).
- 우리는 일반적으로 배아가 햄버거와 해밀턴 단계 10에 도달 인큐베이션의 시작에서 태아에게 약 48 시간 electroporate.
- 부화의 시간 원하는 햄버거와 해밀턴 단계에 따라 다를 수 있습니다. 온도가 최적 배양 온도에서 중요하고 편차 것은 배양 시간 및 감소 배아 생존을 변경합니다.
- 부화 기간 동안, 계란은 배아가 제대로 electroporation에 대한 위치를되도록 자신의 양쪽에 보관해야합니다. 난자는 노른자 위에 떠되며 어디자를 알고 그래서 윈도우 전에 연필로 계란의 맨 위에 표시하기 위해 도움이됩니다.
준비
- 37 ° C.에 따뜻한 Leibovitz L - 15 미디어 바늘에 유리 모세관을 당기세요. 위치 전극과 micromanipulator 및 펄스 발생기에 전극을 연결합니다.
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토론
이 프로토콜은 HH10 여자는 태아의 신경 튜브 electroporation 단계 가이드에 의해 단계를 제공합니다. 기술을 보여주는 이외에도, 스토리지 및 계란의 취급에 대한 지침도 제공됩니다. 이 기술은 유전자 분석을위한 어플 리케이션의 광범을 가지고 있으며, 실험의 용이성과 낮은 비용으로 많은 실험실 위해이 가능합니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 닭알 부화기 | 가습 처리하고, 37.80으로 설정함°C (100F). | ||
| 펄스 발생기 | 제네트로닉스(Genetronics) | BTX T820 | 구형파 발생기 또는 이에 준하는 장치 |
| 전극 | 전극은 직경 0.25 mm의 백금선으로 제작하였으며, 길이는 5 mm, 전극 간 간격은 1 mm로 설정하였습니다. | ||
| 커넥터 케이블 | |||
| 마이크로매니퓰레이터 | |||
| 해부용 스코프 | 긴 작동 거리의 | ||
| 유리 모세관 | 및 모세관 인입기(capillary puller) 또는 상용 유리 니들 | ||
| 라이보비츠’L-15 배지 | |||
| 닭의 알 | 수정된 | ||
| 곡선 가위 | |||
| 10 ml 주사기 | |||
| 대구경 바늘 | 16-18G | ||
| 입 파이펫팅 | |||
| 인디아 잉크 | |||
| 인슐린 주사기/주사기 | |||
| 플라스미드 DNA | ≥ 1μg/μ0.05% Fast Green 염료가 포함된 멸균 TE 또는 1X PBS 1 ml |
참고문헌
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
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