병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

요약

이 문서 그대로의 고립과 정화하는 방법을 설명합니다 Legionella 함유 vacuoles (LCVs). 두 단계 프로토콜은 밀도 기울기 원심 분리에 의한 세균성 LCV 표시 나아가 정화에 대한 항체를 이용한 immuno-자성 분리함으로써 LCV 농축 구성되어있다.

초록

기회 병원체 Legionella pneumophila도 따라서 중증 폐렴 'Legionnaires'병 ^{"1 원인이} 폐포 macrophages에 복제 아메바에 강한 세균이다. protozoan과 포유류의 phagocytes에서, L. pneumophila는 구체적이고 복제 허용 구획, "Legionella 함유 공포를"(LCV) 결성 보존 메커니즘을 고용합니다. LCV 형성은 호스트 세포에 많은 275으로 "이펙터"단백질 translocates 세균성 ICM / 도트 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)를 필요로합니다. effectors는 호스트 단백질뿐만 아니라 lipids를 조작하고 분비, endosomal 및 mitochondrial organelles ^2-4와 통신합니다.

LCVs의 형성은 reductionist의 방식으로 이해하기 어려운 복잡한 강력하고 중복 프로세스를 나타냅니다. 통합 접근 방식은 종합적 경로의 세계적인 분석을 포함하여 LCV 형성을 이해하는 데 필요한ogen - 호스트 요소의 상호 작용과 그 시간적 및 공간적 역학. 이러한 목표를 향한 첫 단계로서 그대로 LCVs이 정화되고 proteomics와 lipidomics으로 분석했다.

조성과 병원균 함유 vacuoles 형성은 액체 크로마 토그래피 또는 대량 분석법에 결합하여 2-D 겔 전기 영동을 사용 proteomic 분석에 의해 조사되었다. 사회적 토양 아메바 Dictyostelium의 discoideum이나 포유 동물 phagocytes 중 격리 Vacuoles는 Leishmania ^5, 리스테리아 ^6,은 Mycobacterium ^7, Rhodococcus ^8, 살모넬라균 ⁹ Legionella SPP을 숨겨두고. ^10. 그들은 예를 들어 전자 현미경은 LCV의 형태, 무결성 및 순도를 분석할 필요로하지만, 이러한 연구들에서 사용된 정화 프로토콜은 시간이 오래 걸릴 지루한입니다. 또한 이러한 프로토콜은 실내의 병원균 공포의 특정 기능을 이용하지richment.

여기에 제시된 방법은 시각을 채용하여 이러한 한계를 극복 형광 LCV 마커를 생산 discoideum 및 세균성 효과기 단백질 SidC을 대상으로하여 어떤 선택 (PtdIns (4) P) 4 - 인산 phosphatidylinositol에 ^3,11을 바인딩하여 LCV 막에 앵커. LCVs는 고전 Histodenz 밀도 기울기 원심 분리 ^12,13 (그림 1)에 의해 두 번째 단계에 따라 SidC와 자기 구슬로 결합된 이차 항체, 대한 친화력 - 정화 일차 항체를 이용한 immuno-자성 분리에 의한 첫 번째 단계에서 풍부하고 .

D.으로부터 격리된 LCVs의 프로테옴 연구 discoideum ¹³ 전에 LCV 형성에 연루되지 않았 phagocytic vesicles, mitochondria, 응급실 및 잠돌군 Zz뿐만 아니라 여러 GTPases와 관련된 단백질을 포함한 560 개 이상의 숙주 세포 단백질을 발표했다. LCVs이 풍부하고 함께 정화프로토콜은 더욱 현미경 (immunofluorescence, 전자 현미경), 생화 학적 방법 (서양 얼룩) 및 proteomic이나 lipidomic 접근하여 분석할 수있다 여기서 설명했다.

프로토콜

1. LCV 절연을위한 준비

1. Legionella pneumophila는 LCV 절연 전에 5 μg / ML chloramphenicol (캠) 4 일 동안 CYE 한천 플레이트에 글리세롤 주식에서 DsRed-Express에서 ^{13,14 생산} 밖으로 행진. 37 세균을 품어 ° C.
2. 1 × 10 ⁷ 종자 디 GFP-calnexin 또는 75cm ^두 조직 문화에 RAW264.7 murine macrophages를 생산 discoideum 언젠가 전에 감염을 flasks. 20 μg / 디위한 ML G418처럼 10 ML HL5 매체를 사용하여 23 ° C.에 discoideum과 amoebae을 품어 RAW264.7 macrophages 10 % FCS (열 inactivated)과 1 %의 글루타민과 함께 보충 10 ML RPMI 1640 배지를 사용하고 37에서 세포 성장을 위해 ° C에서 5 % CO _2.에게 감염 및 샘플마다 적어도 세 75cm ² flasks를 (최소 6 X 10 ⁷ 세포)를 사용합니다.
3. L.과 하룻밤 ....

토론

이전에 다음 ID로 출판 메소드와는 달리,이 프로토콜은 두 단계 먼저 immuno-마그네틱 방식에 의한 LCVs의 분리, 둘째, 밀도 기울기 원심 분리에 의한 LCVs의 정화를 기준으로합니다. LCV 절연 쉽게 fluorescently 분류 박테리아와 GFP 생산 세포 또는 항체 염색법 중 하나를 사용하는 형광 현미경, 다음에 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 높은 순도와 LCVs의 농축에 결과 단순 스트레이트 포워드 방법입니다. 중요한 것은, 균질화 버퍼에 테아제 억제제는 RAW264.7 macrophages 필요하지만, D.의 discoideum ¹³ 선택 사항입니다.

원칙적으로 프로토콜은 분리 단계에 필요한되는, 구체적이고 선택적으로 현지화 표식이 존재하는만큼, 다른 병원균이나 호스트 세포를 위해 채택됩니다. 이상적으로, 별개의 마커는 세균성 원산지 공포 막으로 운반이다차 선택적으로 거기 현지화. 다른 숙주 세포의 구획과 병.......