방법 논문

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

DOI:

10.3791/4140

⸱

2012년 6월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

강력한, 소규모 HELA 핵 추출물의 준비를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 약물이나 RNAi로 치료 세포와 같은 세포의 작은 인구의 사용을 요구 assays를위한 가치있는 것입니다. 방법은 유전자 발현 assays 및 환자 세포 등 다른 세포 유형의 다양한 적용해야합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 유전자 발현의 진행의 큰 거래는 체외 시스템에 사용하였습니다. 대부분의 연구 내용은 기능적인 assays는 정지 재배 세포의 10-50 이상 리터에서 대량으로 준비하고 있습니다 추​​출물을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 대규모 준비는 체외 효과에 신속하게 테스트하는 의무가없는 그 생체내 세포 치료법이나 조건에서 다양한 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 이 저널 비디오 기사는 예로 HELA 세포를 이용하여 기능성 소규모 핵 추출물 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 자기편 monolayers로 성장 세포와 같은 몇 가지 150 셋처럼 mm 접시를 사용하여 수행됩니다. 소규모 추출물의 효율성을 설명하기 위해, 우리는 그들이 결합 RNA 중합 효소 II의 전사 / 접합 반응에 대한 대량 핵 추출물만큼 활성임을 보여줍니다. 추출물 프로토콜의 유틸리티를 입증하기 위해, 우리는 접합이 HELA 세포에서 준비 추출물에 폐지되는 표시S는 접합 억제제 약물 E7107로 치료. 소규모 프로토콜은 세포 추출물을 사용하여 체외에서 조사받을 수있는 절차 또는 세포 유형에 일반적으로 적용할 수 있어야합니다. 이들은 작은 세포 집단의 사용을 요구 약물, DNA를 손상 대리인, RNAi, 또는 transfection 등 다수의 대리인에 노출 한정된 수량이나 세포에서만 사용할 수있는 환자의 세포를 포함합니다. 또한, 갓 자란 세포의 소량이 편리 및 / 또는 일부 응용 프로그램이 필요합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 핵 추출을위한 성장 HELA 셀

  1. DMEM 미디어 세 가지 150mm 차량 번호판 플레이트 HELA 세포는 10 % FBS와 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충. 세포가 90 % 합류 때까지 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 성장.

삼일 분할 후 합류 판과 수확의 1시 10분 팁 - 분할 세포.

팁 - 추가 판은 세 접시와 충분한 세포 (예를 들어, 세포 이하 90 % 이상 합류하는 경우)가 아닌 경우에 성장 할 수 있습니다.

2. 원자력 추출 솔루션을 준비하고 풀어

  1. 표 2에 명시된 바와 같이 신선한 솔루션을 준비합니다.
  2. 15 ML 팔콘 튜브에 Hypotonic 버퍼의 나누어지는 10 ML. 1.5 ML Eppendorf 튜브로 나누어지는 높은 소금 버퍼와 낮은 소금 버퍼 1 ML 1 ML합니다. 얼음 버퍼를 풀어. (참조 사용하기 각각의 버퍼에 PMSF와 DTT의 해당 볼륨을 추가합니다 즉시 이전

3. 핵 추출을위한 HELA 세포를 수확

  1. 세포에서 미디어를 대기음 및 플레이트 방마다 온도 1X PBS 13 ML과 함께 한 세포를 씻는다.
  2. PBS 세척 소 기음.

그리고 몇 초 정도 대기하고, 나머지는 aspirating 그 쪽 플레이트 서 먼저 aspirating하여 많은 PBS의 가능한 한 팁 - 기음.

  1. 셀 리프터를 사용하여 플레이트의 하단 가장자리로 세포를 밀고하고 Eppendorf 튜브에 세포를 전송합니다. 거품을 만들어 피하십시오. 스크랩한 세포의 세 접시 하나 1.5 ML Eppendorf 튜브에 맞게해야합니다.

팁 - 그건 Eppendorf 튜브를 사용하는 경우에는 세포의 볼륨을 추정하는 것이 더 쉽습니다. 스케일에, 팔콘 튜브를 사용합니다.

  1. 펠렛 세포에 XG 100에서 5 분 microfuge에서 4 ° C에서 원심 분리기.

4. Hypotonic 버퍼에 HELA 세포를 팽창

  • 조심스럽게 세포 펠렛에서 PBS를 기음과 튜브에 그라데이션을보고하여 포장 셀 볼륨 (PCV)가 예상됩니다. HELA 세포의 세 지류 번호판은 PCV의 약 500 μl를 얻을 수 있습니다.
  • 세포 펠렛에 Hypotonic 버퍼의 PCV를 2X 추가합니다. 세포를 resuspend 위해 부드럽게 흔들어. 부드럽게 필요한 경우와 아래로 pipetting하여 세포를 resuspend하기 P1000 Pipetman을 사용합니다.
  • 펠렛 세포에 XG 100에서 5 분 microfuge에서 4 ° C에서 원심 분리기. * 세포 이번에 의해 팽창하기 시작하며, 세포 볼륨은 이제 750 μl-1000 μl에 대해 여야합니다.
  • 조심스럽게 Hypotonic 버퍼를 기음과 1.5 ML의 최종 볼륨에 새 Hypotonic 버퍼를 추가합니다. 세포를 Resuspend.
  • 10 분 동안 얼음 resuspended 부풀어 세포를 품어.

    • 5. 다운스 호모 지 나이저를 사용하여 셀을 Lyse

    1. dounce을 씻어 후 얼음에 진정 Hypotonic 버퍼를 사용합니다. 섬세한 작업 wip와 유봉 건조를 닦아어 (예 : Kimwipe). 1000 μl 확장 micropipette 팁을 사용하여 dounce에서 나머지 버퍼를 제거합니다.
    2. dounce에 부풀어 세포를 전송합니다. 천천히 거품을 피하기 위해주의되고, 세포 lyse 위해 5 번 dounce의 꽉 유봉을 아래로 이동.
    3. dounce로부터 세포를 5 μl 나누어지는를 사용하여 세포 용해에 대한 분석. Eppendorf 튜브에 나누어지는를 삽입하고 Trypan 블루의 동등한 볼륨을 추가합니다. 슬라이드에 섞어 넣고 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다. lysed 세포의 핵은 파란색으로 표시됩니다. 90 %의 용해가 이상적입니다.

    팁 - 세포 dounced되어야 횟수가 dounce의 죄어져 있음에 따라 달라질 수 있습니다. 처음으로이 프로토콜을 수행하면 dounce 각 뇌졸중 후 단계 5.3 실시하여 dounce하는 횟수를 결정합니다. 오버 dounce하지 마, 과도한 douncing은 핵을 파괴합니다.

    1. 미리 chille로 lysed 세포를 전송D Eppendorf 튜브와 1500 X g에서 5 분 4 ° C에서 microfuge에 스핀. 펠렛은 핵이 들어 있습니다. 조심스럽게 핵을 방해하지 않고 새로운 튜브로 뜨는을 전송. 뜨는는 세포질이 들어 있습니다.

    팁 - 세포질은 대량 추출물 (대량 추출물에서 활성 S100을 준비를 위해 1 참조)에 사용된 것과 같은 고속 스핀을 사용하여 그대로 사용하거나 더 S100으로 처리할 수 있습니다.

    6. 핵에게 소금 추출

    1. 튜브에 그라데이션을보고하여 포장 원자력 볼륨 (PNV)를 예상됩니다. 500 μl의 PCV는 일반적으로 400 μl의 PNV를 얻을.
    2. 튜브의 바닥에 micropipette 팁을 삽입하고 천천히 한동안 부드럽게 혼합 핵으로 버퍼를 squirting하여 핵으로 낮은 소금 버퍼의 ½ X PNV를 추가합니다. pipet 위아래하지 마십시오. 부드럽게 펠렛 완전히 계속하기 전에 낮은 소금 버퍼에 resuspended되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 버려.
      3. <리> 추가 ½ X 높은 소금 버퍼 빠르게 반전 튜브로 1 시간을 믹스 PNV. 흔들지 마세요. 30 분 동안 4 ° C에서 회전합니다.

    그들을 lysing 피하기 위해 높은 소금 버퍼에있는 핵 신사가 참고하라.

    1. 18,000 X g에서 15 분 microfuge에서 4 ° C에서 봐. 뜨는가 높은 소금 핵 추출물 (HS-NE)입니다. 세포의 세 접시는 일반적으로 HS-NE의 500-600 μl를 얻을 수 있습니다.

    7. 핵 추출을 집중하고 Dialyze

    1. 냉장 미니 centricons (Amicon) 및 14,000 X g에서 microfuge 4시 50 분 ° C에 대한 핸들을 HS-NE 500 μl를 전송합니다. 미니 centricon (Amicon) 반전과 새로운 Eppendorf 튜브에 넣습니다. 4에서 2 분 스핀 ° C HS-NE를 복구하기 위해 1,000 XG. HS-NE는 약 115 μl에 집중됩니다.
    2. P200 Pipetman 이용하여 미니 투석 슬라이드--Lyzers으로 HS-NE 45 μl aliquots를 전송, 및 50에 배치냉장 투석 버퍼 0 ML. 슬라이드-A-Lyzer의 바닥은 시체의 하단에 정렬되었는지 확인하십시오. 4 ° C.에 1-2 시간 동안 저어 NE는 투석 후 흐림 나타납니다.

    팁 - 기분이 원심 분리는 추출물의 활동을 감소로서, 투석 후 관찰되는 뿌연 침전물을 제거하기 위해 원심 분리기 없습니다.

    1. NE는 즉시 사용하거나 aliquoted 수 있습니다. Aliquots는 플래시가 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장해야합니다 NE는 저장 및 활동을 잃지 않고 최소한 두 냉동 해동 사이클을 받아야 할 수 있습니다.

    8. 대표 결과

    최근 접합에 RNAP II의 전사를 커플링에 대한 체외 시스템의 효율은 2-5 개발되었다. 이러한 시스템은 대량 재배 HELA 세포를 고용하기 때문에 빠른 속도로 여러 샘플을 특정 세포 치료의 효과를 테스트 의무가 없습니다. 을 바탕으로이 필요ND 소규모 추출물 프로토콜의 일반 유틸리티 (토론 참조), 우리는 강력한 소규모 핵 추출 방법을 만들었습니다. 대량 핵 추출물과 소규모 핵 추출물에 RNAP II의 전사 / 접합 반응을 비교하는 대표적인 데이터는 그림 2에 표시됩니다. CMV 프로 모터를 포함하고 표준 접합 기판 (Ftz 3, 그림 2A)이 분석에 사용된 인코딩 CMV-DNA 구조. 이 구조는 대량 (차선 1-3) 또는 소규모 (4-6 차선) 추출물에 incubated되었을 때, 미리 mRNA 어렸을때 비슷한 수준은 5 분 시점 (그림 2, 레인 1과 4에 의해 합성되었다 ). 추가 전사를 차단하는 α-amanitin의 추가에 따라 접합의 중간체 및 spliced ​​제품 추출물의 두 가지 유형 (그림 2, 레인 2, 3, 5, 6)에서 유사한 운동으로 시간이지나면서 누적. 이러한 대표적인 결과가 보여 그 쿠데타의 효율성 LED RNAP II의 전사 / 접합 시스템은 벌크 및 소규모 핵 추출물에서 비슷합니다.

    소규모 추출 방법의 유틸리티를 보여주려면 추출물은 접합 억제제, E7107, 또는 부정적인 제어 화합물 pladienolide F 6,7 그리고 결합 RNAP II의 전사 / 접합 분석이 진행되었습니다 대우 HELA 세포에서 준비되었다. 그림 3 Pladienolide의 F와 E7107 치료 세포 (10 분 시간 점) 모두에서 준비 추출물에 효율적으로 발생 RNAP II에 의해 전사로 표시. 반대로, 접합은 Pladienolide F-취급 세포에서 준비 추출물에 정상적으로 발생하지만, (그림 3, 20-60 분 시간 점) E7107-대우 세포에 폐지되었다. 이러한 데이터는 작은 규모의 셀 특별한 치료 소규모 핵 추출물을 사용하기위한 개념 증명을 제공합니다.

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    1 그림. 소규모 추출 프로토콜의 개략도. P1으로 나오세요. 셀은 monolayers으로 성장 세포 리프터를 사용하는 접시에서 수확 및 hypotonic 버퍼의 추가에 의해 부었어요. P2 단계. 세포 Dounce의 균질 화기를 사용 lysed 및 펠렛에 핵 centrifuged있다. P3 나오세요. 핵은 세포질에서 분리하고 소금 추출을 받아야합니다. P4 단계. 핵 추출물을 농축하고 dialyzed됩니다. P5 단계. 결과는 핵 추출물은 (더 자세히 그림 2 참조) 작동하는 그 드라마를 얻을 수 있습니다.

    figure-protocol-1

    그림 2. 소규모 핵 추출물이 결합 RNAP II의 전사 / 접합 분석에 강력한 있습니다. A. 결합 RNAP II 전사 / 접합에 사용되는 CMV-Ftz의 DNA 템플릿의 개략도. CMV 프로 모터와 exons과 인트론의 크기가 표시됩니다. 결합 RNAP의 B. 비교대량 핵 추출물 또는 소규모 핵 추출물을 사용하여 II 전사 / 접합 분석. 전사 및 접합의 5 분, 30 및 60 분 동안 발생하는 허용된 이후 α-amanitin가 추가되었습니다. RNA가 추출되고 fractionated 5 % denaturing polyacrylamide 겔와 phosphoimager에 의해 발견되었다. 접합의 중간체 및 제품이 표시됩니다. 내생 U6 snRNA와 tRNA는 추출물에 제시 및 32 인큐베이션 기간 동안 P-레이블이 표시됩니다 특징이다. 결합 RNAP II의 전사 / 접합 시스템의 상세한 프로토콜에 대해 3을 참조하십시오.

    figure-protocol-2
    그림 3. 접합 억제제 약물 E7107로 치료 HELA 세포에서 준비 소규모 핵 추출물은 접합에 결함이 있습니다. 셀은 3 μm의 제품 Pladienolide로 치료되었다 F 또는 E7107 등6을 설명하고 소규모 핵 추출물 준비를 위해 사용됩니다. 시간 과정은 그림 2에서와 같은 녹음 / 접합 분석을 사용하여 실시되었다. 접합의 중간체 및 제품, U6 snRNA와 tRNA가 표시됩니다.

    토론

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    우리는 monolayers으로 성장 HELA 전지의 소량의 핵 추출물의 준비를 위해 신속하고 재현성 방법을 확립했습니다. 우리는이 추출물은 RNAP II의 전사 / 접합 assays의 동력학과 효율성은 소규모 및 대량 핵 추출물에서 유사한 것을 보여주는 것만으로도 강력한는 것을 보여주었다. 우리는 접합 억제제 약물로 치료 세포에서 준비 추출물이 전사하지만, 접합의 결함에 대해 활성 중입니다 그 입증하여 추출물의 유틸리티를 보여주었다.

    소규모 핵 추출물 준비를위한 우리의 방법은 이전에 대규모 1,8의 정지 재배 HELA 세포의 추출물과 추출물 9 소규모 준비를위한 방법을 만들기 위해 정해진 방법을 결합 및 최적화에 의해 설립되었습니다. 이전의 소규모 추출물 등 결합 녹음 / SP로, 일부 assays를위한 기능성하지 않았기 때문에 우리는 우리의 프로토콜을 설립분석을 licing. 이전의 소규모 프로토콜 9과 우리 사이의 중요한 차이점은 이전 프로토콜이 작은 게이지 바늘 9까지 그들을 추진하여 세포를 lysed 반면, 우리가 미니 dounce을 사용하여 세포를 lysing위한 조건을 최적화한다는 것입니다. 추출물 일부 assays에 대한 재현해 비활성 및 / 또는 어려웠다 이유를 설명 수도 거품의 바늘 용해 결과. 우리는 또한 우리의 프로토콜에 농도 단계를 추가했다. 이 단계는 농도에 매우 민감 추출물의 활동을 증가 시키며, 또한 소규​​모 준비에 내재된입니다 추출물 간의 다양성을 제한합니다. 마지막으로, 우리의 준비는 일상적으로 대량 추출에 비해 활동에 어떤 큰 영향없이 단일층 전지의 세 개만 150mm 접시로 수행됩니다. 따라서, 프로 시저는 값비싼 시약 또는 제한된 셀 가용성을 필요로 소규모 준비를위한 즉시 의무가있다. 예를 들어, 우리는 SMA를 준비했습니다됩니다 규모 RNAi의 최저 세포에서와 만성 림프 백혈병 (CLL) 환자 세포에서 추출물,하고 기능 및 / 또는 생화 학적 assays (EGF, JLH, 타이와 RR, 게시되지 않은)에 대해 이러한 추출물를 사용했습니다. 우리는 RNAi와 같은 immunopreciptations, 서부 영화, 그리고 실버 염색법과 같은 특정 생화 학적 assays, 그 다음에 대한 추출물은 가치있는 것으로 나타났습니다. 특정 단백질을 노크의 효능을 맺은 후, 더 자세한 연구는 저렴한 비용으로 추가 추출물을 준비하는 데 사용할 수있는 안정적인 최저의 세포 라인을 만들어 실시 할 수 있습니다. 단백질의 질량 분광법은 또한 메서드의 유용한 어플 리케이션이 될 것입니다 이러한 최저의 세포 라인에서 얻은 immunoprecipitates로 제시. 우리 마을은 우리가 프로토콜에 대한 예제로 사용되는 결합 전사 / 접합 분석 이외에 소규모 추출물은 다른 일에 사용되는 것처럼 다양한 기능 및 생화 학적 assays에 일반적으로 적용되어야유전자 발현의 EPS (상한, 접합, 전사, polyadenylation, microRNA 처리 예). 프로토콜도 어느 서스펜션에서 얻어진 (예 : CLL 세포) 또는 (예 : 환자의 섬유아 세포 등) 문화로 성장하실 수 있습니다 환자의 세포 유형에 적응하실 수 있습니다. 마지막으로, 절차를 수행하는 동안 얻은 세포질 분획은 세포질이 필요한 기능과 생화학 두 assays에 대한 유용합니다.

    공개 사항

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스가 Abcam, PLC에 의해 후원된다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    우리는 M. Winkelbauer - 상처, E. 이브라힘, P. 발렌시아, K. Dufu, 유용한 토론을위한 H. 쳉에게 감사합니다. HELA 세포는 국립 셀 문화 센터 (미네 아 폴리스, 미네소타)에서 얻은되었다. 우리는 또한 가벼운 현미경으로 도움을 하버드 의대에서 E7107과 니콘 이미징 센터를 제공하는 Eisai 주식 회사 감사합니다. 이 작품은 JLH하는 RR과 EGF와 NRSA 사귐에 NIH 교부금 GM043375에 의해 지원되었다.

    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    시약의 이름 시약의 전체 이름 회사 카탈로그 번호
    HEPES 4 - (2 - 히드록시 에틸) piperazine-1-ethanesulfonic 산 시그마 H3375-500G
    MgCl 2 0.6 H 2 O 마그네슘 염화물 Hexahydrate 시그마 M2670-500G
    KCl 염화칼륨 어부 P335-212
    PMSF Phenylmethanesulfonyl 불소 시그마 P7626-100G
    DTT Dithiothreitol Bioanalytical 미국 AB00490-5G
    EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) Ethylenediaminetetraacetate, 나트륨, 이수화물 Bioanalytical 미국 AB00500-01000
    글리세린 MP의 Biomedicals 800,689
    DMEM Dulbecco의 최소 필수 매체 Invitrogen 11995-073
    FBS 태아 소 혈청 Gibco 16,140
    페니실린 / 스트렙토 마이신 Gibco 15,070
    PBS 인산염은 염분 버퍼 Cellgro 21-040 - 이력서
    Trypan 블루는 0.4 %를 청바지 Gibco 15,250
    세포 흡착지 코닝 29442-200
    150mm 플레이트 VWR 353,025
    확장 Micropipette 팁 Denville P1126
    꽉 유봉과 균 질기, 1ml를 Dounce Wheaton의 357,538
    Slidealyzers, MWCO 10kDa ThermoScientific 69,572
    미니 Centricons, MWCO 3kDa Millipore (Amicon) UFC500396

    표 1. 특정 시약 및 장비.

    용액 최종 재고 조제하다
    Hypotonic 10 MM HEPES, pH를 7.9 1M HEPES, pH를 7.9 5 ML
    1.5 밀리미터 MgCl 2 1M MgCl 2 750 μl
    10 MM KCl 3M KCl 1.67 ML
    0.2 MM PMSF 200 MM PMSF 500 μl
    0.5 밀리미터 DTT 2M DTT 125 μl
    물 500 ML까지 지참
    낮은 소금 20 MM HEPES, pH를 7.9 1M HEPES, pH를 7.9 이 ML
    1.5 밀리미터 MgCl 2 1M MgCl 2 150 μl
    20 MM KCl 3M KCl 667 μl
    & NBSP; 0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 40 μl
    25 % 글리세롤 글리세린 25 ML
    0.2 MM PMSF 200 MM PMSF 100 μl
    0.5 밀리미터 DTT 2M DTT 25 μl
    물 100 ML까지 지참
    높은 소금 20 MM HEPES, pH를 7.9 1M HEPES, pH를 7.9 이 ML
    1.5 밀리미터 MgCl 2 1M MgCl 2 150 μl
    1.4M KCl 3M KCl 48 ML
    0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 40 μl
    25 % 글리세롤 글리세린 25 ML
    0.2 MM PMSF 200 MM PMSF 100 μl
    0.5 밀리미터 DTT 2M DTT 25 μl
    물 100 ML까지 지참
    투석 20 MM HEPES, pH를 7.9 1M HEPES, pH를 7.9 10 ML
    100 MM KCl 3M KCl 16.625 ML
    0.2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl
    20 % 글리세롤 글리세린 100 ML
    0.2 MM PMSF 200 MM PMSF 500 μl
    0.5 밀리미터 DTT 2M DTT 125 μl
    물 500 ML까지 지참

    표 2. 핵 추출물 준비를위한 솔루션.

    참고문헌

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
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    9. Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).

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