이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비 1,2, 리포좀 압출 및 크기 특성화는 제한된 표시됩니다.
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방법 논문
나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Liposomes는 광범위하게 단백질 - 단백질과 단백질 - 지질 상호 작용 3, 모니터 약물 전달 4,5, 그리고 캡슐 4 공부하는 플랫폼을 흉내낸 세포막로 사용되는 천연 및 합성 phospholipids로 이루어진 인위적으로 준비 vesicles 있습니다. Phospholipids 자연스럽게 마이셀에서 자신을 구별, 곡선 지질 bilayers을 작성 6. Liposomes은 전통적으로 bilayers, 즉 대형 unilamellar vesicles (LUVs), 작은 unilamellar vesicles (포드 SUV 차량용) 및 multilamellar vesicles (MLVs) 7의 크기와 수에 의해 분류됩니다. 특히, 다양한 크기의 균질 liposomes의 준비는 엔도와 exocytosis, 멤브레인 융합, 그리고 단백질 밀매 8, 세포 신호 전달에 중요한 역할을 막 곡률을 공부하는 것이 중요합니다. 400 - 여러 그룹은 단백질이 막 곡률을 포함하기 때문에 직경의 liposomes 준비 과정 <100 조절하는 데 사용되는 방법 분석세포의 기능 3 자신의 행위를 파악하고 NM. 기타 차량에 관심 9 마약을 운반하고 전달로 liposomes을 공부하고, 리포좀은 마약 캡슐에 초점. 리포좀 형성 9시 보고된으로 약물 캡슐이 형성될 수 있습니다. 우리 압출 단계는 두 가지 이유로 캡슐화된 약물에 영향을 미치지 않습니다, 즉 (1) 약물 캡슐이 단계 이전에 달성되어야하고 (2) liposomes 안전 수성 코어에서 마약을 운반, 그들의 자연적인 biophysical 안정성을 유지한다. 이러한 연구 목표는 더욱 안정적인 서브 마이크론 지질 vesicles을 설계하기위한 최적의 방법에 대한 필요성을 제안합니다.
그럼에도 불구하고, 현재 리포좀 준비 기술 (sonication 10, 냉동 및 해동 10, 침전)이 biophysical를 제한 높은 일관성 및 효율성 10,5와 높은 곡면 (예 : 직경 <100 nm의)에 liposomes의 준비를 허용하지 않습니다 emergi의 연구막 곡률 감지의 NG 분야. 여기, 우리는 생물 학적 관련 liposomes 다양한위한 강력한 준비 방법을 제시한다.
가스 기밀 주사기와 폴리 카보 네이트 점막 10,5를 사용하여 수동 압출은 일반적인 관행이지만 구멍 크기가 적용된 매뉴얼의 압력 변화로 인해로 인해 <100 nm의 사용시 이질이 자주 관찰된다. 우리는 직경 30 nm의 400 사이의 범위 합성 liposomes를 준비하는 일정한 압력 제어 압출 장치를 채용. 동적 광 산란 (DL을) 10, 전자 현미경 11 nanoparticle 추적 분석 (NTA) 12 우리의 프로토콜에 설명된대로 상용 폴리스티렌 (PS) 교정 표준으로 사용되는 구슬과 함께 리포좀 크기를 계량하는 데 사용되었다. 근처의 선형 상관 관계는 우리의 압력 제어 리포좀 준비 높은 충실도를 나타내는업자 기공 크기와 실험적으로 결정 liposomes 사이에 관찰 충족되었다석탄통. 더 나아가, 우리는이 지질 소포 준비 방법은 여러 가지 리포좀 크기의 독립, 일반적으로 적용하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 또한 최대 16 시간 동안이 준비된 liposomes 안정 것을 시간 코스 연구에서 증명하고있다. 대표적인 나노 크기의 리포좀 준비 프로토콜은 다음과 시연한다.
프로토콜
1. 리포좀 준비
- 테플론 늘어선 모자와 함께 20 ML의 유리관을 검색합니다.
- 오염을 방지하기 위해 사용하는 사전 클로로포름 모든 유리 제품과 주사기를 청소합니다.
- 250 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 유리관에 시약 등급의 클로로포름 100 μL를 전송합니다.
- 100 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리관에 시약 등급의 메탄올 30 μL를 추가합니다.
- phosphatidylethanolamine (교황) : 2 MM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC) 준비하려면 콜레스테롤 지질 솔루션을, 11 밀리그램 / ML 10 밀리그램 / ML 교황과 20 μL의 μL 10 밀리그램 / ML POPC, 42의 216 μL를 전송 20 ML의 유리관에 CHCl 3 콜레스테롤 솔루션.
- lipids의 박막은 유리병의 바닥에서 발견된 때까지 느린 흐름 아르곤 또는 질소 가스를 사용하는 유기 용제를 증발.
- 잔류 용매를 제거하려면 최소 30 분 동안 진공 건조기에서 uncapped 유리관를 놓습니다.
- TR버퍼의 ansfer이 ML은 이전에 하이드 레이트 lipids를로 유리관에, 0.2 미크론 필터를 통....
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토론
Avestin Liposofast LF-50 압출기를 사용하여, 우리는 얼마나 작은 크기, 합성 liposomes는 압력 제어 시스템을 통해 준비가되어 보여주었다. 그것은 multilamellar vesicles 작은 nanoparticles의 생산으로 이어질 수 리포좀 보습, 따라 자발적으로 형성 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 작은 multilamellar vesicles은 필연적으로 대형 필터 기공 제작한 unilamellar vesicles의 솔루션에 이질의 원인, 대형 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공의 크기를 통해 흐를 것이다. 따라서, 그것의 균질성 향상, 큰 기공 크기는 lipids에게 융합과 큰 vesicles로 길어지다 충분한 시간을주기 위해 (위의 설명에 400 nm의 직경 모공을위한 즉, 25 PSI)를 사용하는 경우 질소 흐름의 압력을 줄일 것을 권장합니다 솔루션입니다. <100 nm의, 고압 (위에서 설명된 바와 같이 30과 100 nm의에 대한 즉, 400-500의 PSI)의 직경과 lip.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 공동 혁신 수상에 의해 지원되었다. 램 시그널링 및 건강 교육 기금의 셀룰러 규정 국립 연구소 (T32 GM008759)와 NIH 루스 L. Kirschstein 사전 박사 연구원 (CA165349-01)에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 소중한 의견 교수 마이클 스토 웰 (CU 볼더), 교수 더글러스 말하지 그래과 교수 롭 필립스 (Caltech)에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 클로로포름 | 시그마 - 올드 리치 | 02432-25ML | 95 %의 안정제 |
| 고급 메탄올 | 시그마 - 올드 리치 | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 압출기 | Avestin 주식 회사 | ||
| Phospholipids | 아벤티 폴라 Lipids | ||
| 폴리 카보 네이트 나란하고 세공 | Avestin 주식 회사 | 25mm 직경 | |
| 디스크에게 PE 드레인 | Avestin 주식 회사 | 230,600 | 25mm 직경 |
참고문헌
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H.
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재인쇄 및 허가
