실험 Subarachnoid의 출혈 후 뇌 지연 Vasospasm을 평가하기 위해 낮은 사망 쥐 모델

요약

Aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH)은 때 동맥 파열 subarachnoid 공간에 발생합니다 출혈이 있습니다. subarachnoid의 출혈이 몇 년 전 예전처럼 될 수 계속 한 후이 행사의 병적 상태와 사망률이 개선 치료 방법으로 인해 감소, vasospasm의 위험에 왔지만. 뇌성 vasospasm의 시작 이벤트를 식별하기 위해 포괄적이고 재현 동물 모델을 확립의 중요성은 배리의 1979 년 실험 vasospasm 모델 쥐의 첫 번째 사용하기 때문에 연구의 초점을했습니다 외. 쥐의 초기 작업은 cisterna 마그나에 autologous 피 한 분사가 급성으로 이어 (분 이내)하지만 뇌성 vasospasm을 지연하지 않는 것이 입증 ^{3, 6, 14}. 여기 낮은 사망률 SAH 쥐 모델을 특성화 그 재현 지연 vasospasm의 결과입니다.

초록

목표 : 특징과 시작 이벤트, pathophysiological 변경 및 치료를 위해 잠재적 인 공격 대상을 파악하기 위해 쥐의 aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH) 이후 지연 뇌성 vasospasm을 보여줍니다 재현 모델을 설정합니다.

방법 : 28 남성 Sprague-Dawley 쥐 (250~300g이) - SAH 또는 생리 제어 임의로 두 그룹 중 하나에 할당되었습니다. SAH 그룹 (N = 15)에서 쥐의 subarachnoid 출혈은 cisterna 마그나로, 48 시간 간격, autologous의 피를 두 번 주입에 의해 유도되었다. 마찬가지로, 정상적인 생리 (N = 13)은 cisterna 마그나 생리 제어 그룹의에 주입했다. 쥐가 두 번째 혈액 주입 후 일 곳곳에서 희생되었고 머리는 조직 학적 분석을 위해 보존되었습니다. vasospasm의 정도는 NIH 이미지-J 소프트웨어를 사용하여 내부 luminal 단면적을 측정하여, 뇌 바닥 동맥의 섹션을 사용하여 측정되었다. 의미했습니다Tukey / 크레이머의 통계 분석을 사용하여 테스트했습니다.

결과 : 조직 학적 섹션의 분석 후, 뇌 바닥 동맥 luminal 단면적은 이전 그룹에 뇌성 vasospasm과 일치, 생리 그룹에서보다 SAH의 작은습니다. SAH 그룹에서 뇌 바닥 동맥 내부 지역 (0.056 μm ± 3) 내부 공간과 생리 대조군 (0.069에 비해 5 일 두 번째 혈액 주입 (7 일 초기 혈액 주입 후) 후 vasospasm에서 훨씬 작했다 ± 3, P = 0.004). 뇌성 vasospasm로부터 mortalities이 없습니다.

결론 : 쥐를 두 번 SAH 모델은 작은 동물 모델에서 뇌성 vasospasm의 pathophysiological 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 순한, 생존, 뇌 바닥 동맥 vasospasm을 유도한다. 낮은 허용 사망률이 vasospasm의 메커니즘이 elucid 할 수 있도록 이상적인 SAH 동물 모델에 대한 만족해야하는 중요한 기준입니다ated ^{7, 8.} 모델의 추가 수정은 vasospasm과 신경 시험의 증가 정도에 대한 조정 만들 수 있습니다.

프로토콜

1. SAH 제목에 쥐 수술 0.15 ML Autologous 동맥혈으로 주사

1. 쥐가 0.1 밀리그램 / Xylazine / 케타민 쥐 칵테일 kg을 사용하고 5 분에 앉아서 할 수 anesthetized 있습니다.
2. 충분한 마취는 뒷다리 반사의 감소에 의해 확인된다.
3. 전자 면도기를 사용하여 하위 뒤통수 지역 주변 머리카락 영역을 코 목은 면도 있습니다.
4. 동물은 수술 테이블에 위로 향한 위치와 꼬리는 살균 절개를 보장하기 위해 betadine을 채취합니다.
5. 직선 1cm의 중간 선 절개는 꼬리의 복부 측면에서 이루어집니다
6. 꼬리 동맥이 확인하고 격리 될 때까지 절개가 연장됩니다.
7. 멸균 26 게이지 카테터를 사용하여 꼬리 동맥 cannulated되어 동맥 혈액의 0.15 ML은 주사기로 배출된다.
8. 멸균 거즈은 절개를 밀봉 할 수있는 vetbond의 적용 전에 지혈을 보장하기 위해 절개 감싸 있습니다.
9. 티그는 쥐가 betadine으로 채취되는 하위 뒤통수 지역을 통해 테이블​​과 면도 지역에 발생하기 쉬운 설정되어 있습니다.
10. 수직 중간 선 절개 액세스를 사용하면 cisterna 마그나에 받고있다.
11. 일단 확인 25 게이지 바늘은 cisterna 마그나에 삽입되어 CSF의 0.15 ML은 autologous 혈액 양의 주입으로 증가 intracranial 압력을 피하기 위해 주사기로 배출된다.
12. 이제 꼬리 동맥에서 추출한 혈액의 0.15 ML은 cisterna 마그나에 천천히 주입합니다.
13. 주사 바늘을주의 깊게 철회 다음 subarachnoid 공간에서 응고하기 위해 30 초를위한 자리에 남아 있습니다.
14. 지혈이 보장되고 절개는 stapling 장치를 사용하여 문을 닫습니다.
15. 동물은 이제 뇌 바닥 동맥 주변의 cisterns에 얼고, 혈액을 수 있도록 20 분에 위치 아래로 20 °의 머리 온난화 표면에 발생하기 쉬운 배치됩니다.
16. 1.1-1.15 단계가 분리되어 두 번째 수술 48 시간 동안 반복된다.

2. SAH 제목에 쥐 수술 0.15 ML의 식염과 양념을 넣은

1. 쥐가 0.1 밀리그램 / Xylazine / 케타민 쥐 칵테일 kg을 사용하고 5 분에 앉아서 할 수 anesthetized 있습니다.
2. 충분한 마취는 뒷다리 반사의 감소에 의해 확인된다.
3. 전자 면도기를 사용하여 하위 뒤통수 지역 주변 머리카락 영역을 코 목은 면도 있습니다.
4. 동물은 수술 테이블에 위로 향한 위치와 꼬리는 살균 절개를 보장하기 위해 betadine을 채취합니다.
5. 직선 1cm의 중간 선 절개는 꼬리의 복부 측면에서 이루어집니다
6. 꼬리 동맥이 확인하고 격리 될 때까지 절개가 연장됩니다.
7. 멸균 26 게이지 카테터를 사용하여 꼬리 동맥 cannulated되어 동맥 혈액의 0.15 ML은 주사기로 배출된다.
8. 멸균 거즈은 절개를 밀봉 할 수있는 vetbond의 적용 전에 지혈을 보장하기 위해 절개 감싸 있습니다.
9. RAt는 betadine으로 칠하는 하위 뒤통수 지역 위에 테이블과 면도 지역에 발생하기 쉬운 설정되어 있습니다.
10. 수직 중간 선 절개 액세스를 사용하면 cisterna 마그나에 받고있다.
11. 일단 확인 25 게이지 바늘은 cisterna 마그나에 삽입되어 CSF의 0.15 ML은 주사기로 철회되고 샘플이 저장됩니다.
12. 이제 정상적인 생리의 0.15 ML (37 ° C)은 cisterna 마그나에 천천히 주입합니다.
13. 바늘은 30 초 동안 장소에두고 조심스럽게 취소됩니다.
14. 지혈이 보장되고 절개는 stapling 장치를 사용하여 문을 닫습니다.
15. 동물은 이제 20 분에 위치 아래로 20 °의 머리 온난화 표면에 발생하기 쉬운 배치됩니다.
16. 2.1-2.15 단계가 분리되어 두 번째 수술 48 시간 동안 반복된다.

3. 쥐의 희생

1. 두 번째 수술 후 5 일에서 쥐가 심장 재관류에 의해 희생되어 있습니다.
2. 쥐가 치명적인 복용량 (0 주어집니다치명적인 플러스의 0.2 ML / kg) (VORTECH 제약 LTD., 디어, MI)
3. 수직 중간 선 절개를 통해 복강이 접근되고 복막가 열립니다.
4. 앞 thoracotomy이 수행되고 심장이 노출됩니다.
5. 동물이 피가 다 말라되어 있으며 다음 4 % paraformaldehyde와 perfused되는 인산 완충 용액 (PBS 산도 7.4과의 37 °)에 연결된 26 게이지 카테터를 사용합니다.
6. 적절한 재관류을 보장 후, 재관류이 중지되고 쥐가 목 베기 테이블로 배달됩니다.
7. 목 베기 후, 뼈 rongeur는 뇌 제거를위한 두개골을 제거하는 데 사용됩니다.
8. 뇌와 brainstem는 신중하게 48 시간 동안 두개골 천장에서 추출하고 4 % paraformaldehyde 솔루션에 배치, 4 ° C에 저장됩니다.

4. Vasospasm을 평가하는 섹션을 만들

1. 지금 4 일 동안 30 %의 자당에 잠겨 된 쥐의 뇌는 일에 배달됩니다sectioning에 대한 전자 그라 이오 스탯.
2. 일단 cryoprotected, 12 μM 섹션은 간 주제 일관성을 보장하기 위해 기점으로 앞쪽 하부 소뇌 동맥 (AICA)로, 그라 이오 스탯을 사용하여 만들어집니다.
3. 20 절은 수 페리 어 소뇌 동맥 (SCA)에 종료, 각 동물에 대해 생성됩니다.
4. 섹션은 유리 슬라이드에 배치하고 조직 학적 방법론을 사용하여 vasospasm에 대한 평가

결과

위에 설명 된 프로토콜 내에서, 우리는 이전에 문학에 설명 된 것보다 모델의 더 나은 특성을 필요로한다고 생각되는 몇 가지 단계가 있습니다. 여기 재현 낮은 사망률 뇌성 vasospasm 작은 동물 모델을 달성하고 제대로하지 않을 경우이 모델과 관련된 잠재적 인 함정을 피하기 위해 필수적입니다 단계에 초점을 맞 춥니 다.

1. 꼬리 동맥의 Autologous 혈액 추첨 :

꼬리 동맥의 angiocatheter주의 위치는 모델에 필수적인 첫 단계입니다. 그림-1 쥐의 꼬리 동맥의 26 게이지 카테터의 위치를 보여줍니다. 이 최소한의 외상과 출혈이있는 좋은 위치를 나타냅니다. angiocatheter의 적절한 위치는 좋은 혈액 수익으로 확인 할 수 있습니다.

2. Cisterna 마그나에 Autologous 혈액의 주입 :

토론

영장류에 더 유사한 유전 조성과 해부학 적 특징을 갖는 인간 더 자세히 지연 뇌성 vasospasm의 사건을 모방하고보다 쉽게 쥐 ^8보다 동맥 변경 사항을 모니터링하는 비 침습적 영상을 (MRI 및 혈관 조영술) 받아야 할 수 있습니다. 그러나, 영장류 모델은 비용 금지 및 소형 동물 모델보다 더 복잡한 관리 및 윤리적 문제와 연결되어 있습니다. 개발 된 소형 동물 SAH 모델은 이전에 SAH를 일으킬 세 가지 방법에 초점을 맞추고 있습니다 : 1) Endovascular 동맥 혈액이 subarachnoid 공간으로 탈출하고 부상당한 동맥 주위에 수집 할 수 있도록 허락 해 intracranial 동맥의 천공 2) 동맥의 외과 노출 지역 autologous 응고 분사, subarachnoid 공간 ^8로 피 3) 직접 분사 (autologous 또는 기증자). 모든 모델은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, endovascular 천공 모델은 가장 가까운 aneurys의 이벤트를 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비 / 시약의 이름	회사	카탈로그 번호
남성 SD 쥐 (250-300g)	Taconic	SD-M
26 G의 카테터	웹스터	8416683
25 G의 바늘	물소	305122
1 CC의 주사기	중앙 상점	54,245
케타민 / Xylazine 칵테일	동물 케어 (SUNY) *	-
Betadine	중앙 상점	51,458
자당	시그마	S9378-1kg
Paraformaldehyde	시그마	P6148-500G
인산염 완충 용액	어부	BP-399-4
외과 표	하버드	PY2 72-2590
10월 컴파운드 (cryoprotection)	VWR	25608-930
Superfrost 슬라이드	어부	12-550-15

* 실험실 동물 관리학과, SUNY 북부 출신 의과 대학에서 합성. 한 참조를 추가합니다 [100 MG / ML] [100 MG / ML] 케타민의 10 ML에 Xylazine의.