종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

Summary

침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

Abstract

대부분의 고체 종양의 성장과 진보는 암 세포와 기질 - 연관된 종양 microenvironment ^1에서 신호에 대한 그들의 반응의 초기 변화에 따라 달라집니다. 이전에는 종양 microenvironment에 관한 연구는 주로 종양 - stromal 상호 작용 ^1-2에 주력하고있다. 그러나, 종양 microenvironment도 효과 저조한 이​​해 남아 biophysical 세력, 다양한 포함되어 있습니다. 이들 세력은 유전자 발현의 변화, 세포 분열, 분화 및 침공 ^3로 이어질 종양 성장의 biomechanical 결과입니다. 매트릭스 밀도 ^4, 강성 ^{5-6, 6-7} 및 구조, 중간 유체 압력 ^8, 침입형 유체의 흐름 ⁸ 모든 암 진행하는 동안 변경됩니다.

특히 침입형 유체의 흐름은 정상 조직의 ^8-10에 비해 종양으로 높다. 예상 침입형 유체 층오우 판매율은 측정 및 종양 크기와 차별화 ^{9, 11에} 따라 0.1-3 μm의들 ^-1의 범위에 있어야 발견되었다. 이것은 종양 유발 angiogenesis 및 증가된 혈관 투과성 ^{12 시까지} 인한 고가 중간 유체 압력에 의한 것입니다. 침입형 유체의 흐름은 암세포 ^13-14, 혈관 섬유아 세포 및 평활근 세포 ¹⁵ 침략을 향상을 보여줘왔다. 이 침공은 3-D ¹⁶ 셀 주위 만들거나 모체 metalloproteinase (MMP) 표현 ^15, 케모카인 분비와 세포 유착 분자 발현 ¹⁷ 증가 autologous chemotactic의 그라디언트가 원인일 수 있습니다. 그러나 세포가 유체의 흐름을 감지하는 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포의 행동을 변화 이외에도, 중간 유체 흐름은 종양 microenvironment의 다른 세포의 활동을 modulates. 이것은 종양 - 홍보 myofibr으로 섬유아 세포의 (A) 운전 분화와 관련된oblasts ¹⁸ (b)는 항원과 림프절 ^19, 그리고 (c) modulating 림프 내피 세포 morphogenesis ^{20 ~} 다른 용해 요인에 호송.

여기에 제시된 기술은 체외에서 세포에 침입형 유체 흐름을 부과하고 침공 (그림 1)에 미치는 영향을 quantifies. 이 방법은 stromal 및 암 세포 침입 ^{13-15, 17} 일에 유체 흐름의 효과를 측정하기 위해 여러 연구에 게시되었습니다. 매트릭스 구성, 셀 유형, 및 세포 농도를 변경하면이 방법은 이러한 침략, 분화, 증식 및 유전자 발현 등의 세포 프로세스에 침입형 흐름의 효과를 연구하기 위해 다른 질환과 생리적 시스템에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 분석 설정

1. 4 ° C (약 2 시간)에 얼음 Matrigel의 작은 나누어지는 (<500 μl)을 녹여.
2. 겔 제조법 (아래 표에서 예를 들어 볼륨을 참조) 준비 : 10X PBS (총 판매량 1X), 1N 수산화 나트륨을 (추가 콜라겐의 0.023 권에 상응하거나 콜라겐 제조 업체의 권장 사항마다 적절한 등), Matrigel과 콜라겐이에 나를 입력 1 MG / ML 및 1.3 밀리그램 / 각각 ML (다른 매트릭스 공법은 세포 종류와 실험에 따라 사용될 수있다)의 최종 농도.

예 겔 제조법

구성 요소	주식 농도	최종 농도	볼륨을 추가
10X PBS	10X	1X	0.090 ML
멸균 물			0.346 ML
1N NaOH....

Discussion

여기에서 우리는 세포 배양 삽입 내에 3 차원 매트릭스에 포함된 세포를 이용하여 종양 세포 침공에 침입형 흐름의 효과를 quantifying위한 방법론을 설명했습니다. 이것과 유사한 방식이 세포 유형에 ^{13-15, 17의} 다양한 침입형 흐름의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리의 접근 방식은 일부 유형을 사용하여 종양의 매트릭스 microenvironment을 모방한 것이었 나 상피 조직과 주변 기질 ^21-22 지하 막에서 발견된 단백질을 포함 콜라겐과 Matrigel. 이 시스템은 비교적에 설정 쉽고 간단하며 비용이 훨씬 더 체외 ^23-24에 침입형 유체의 흐름을 연구하는 데 사용되는 대부분의 microfluidic 장치를보다 효과적입니다. 그것은 펌프 또는 전문 장비가 필요하고 동시에 테스트할 수 있도록 여러 조건을 허용하지 않습니다. 또한, 측정은 일반적으로 침략과 migra를 테스트하는 데 사용되는 기존 Boyden 챔버 assays 분들 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 (쥐 꼬리)	BD	354,236	무균 유지
Millicell의 세포 배양 삽입	Millipore	PI8P01250	8 μm의 기공 직경, 폴리 카보 네이트 멤브레인
Matrigel	BD	354,234	무균 유지
PBS	시그마 알드리치	100M-8202	단계를 빨 겔 솔루션 1X를 준비하기위한 10X
수산화 나트륨, 1.0N 솔루션	시그마 알드리치	S2770	무균 유지
DMEM 1X	CellGro	10-013 - 이력서	무균 유지
태아 소 혈청	애틀랜타 체액	511,150	무균 유지
페니실린의 스트렙토 마이신	CellGro	30002CI	무균 유지
트리톤 X-100	시그마 알드리치	X100-500 ML	PBS의 0.5 %
Paraformaldehyde	피셔 과학	04042-500	PBS의 4퍼센트
탈이온수			무균 유지
4 ', 6 diaminido-2-phenylindole (DAPI)	MP의 Biomedicals	0215757401	1 MG / ML 주식 솔루션
마운트 솔루션	써모 과학	TA-030-FM
트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	CellGro	25-052-CI	무균 유지