심장 핵은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.
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이 논문에서
요약
초록
대부분의 전략에만 세포질 마커 단백질 1에 의존로 cardiomyocyte 핵의 식별은 조직 섹션에 도전했습니다. 이러한 증식과 apoptosis와 같은 심장 myocytes에서는 드문 행사 심장 myocyte 핵의 정확한 신원은 항상성 및 병리 학적 조건 2의 세포 갱신을 분석해야합니다. 여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)와 후속 유동세포계측법 정렬에 대한 항체가있는 밀도의 침강 및 immunolabeling으로 해부 조직에서 cardiomyocyte 핵을 분리하는 방법을 제공합니다. 이 전략은 신선한 조직 및 냉동 보관 물질에 동일하게 작업의 장점과 높은 처리량 분석 및 절연을 허용합니다. 이렇게하면 이미 biobanks에서 수집한 자료를 공부할 수 있습니다. 이 기술 적용과 종의 광범위한 테스트와 같은 탄소-14 데이트 3 셀 - 사 등 여러 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하다CLE 분석 4, thymidine의 analogues의 시각화 (예 : BrdU와 이두) 4, transcriptome 및 epigenetic 분석.
프로토콜
1. 심장 핵의 분리
- 1퍼센트 BSA / PBS 코팅 용액의 10 ML과 코트 ultracentrifuge 튜브 (Beckman의 원심 분리기 튜브 # 363664). 튜브를 모자하고 그들 튜브 회전에서 30 분 동안 회전하자. 코팅 용액을 제거하고 원심 분리기 튜브 공기 건조 (마우스 심장 당 하나의 튜브가 다른 종류의 단일 마우스 하트, 번갈아 최대 5 마우스의 마음이나 심장 조직의 1g의 분석에 필요한하게 (예 : 인간) 처리할 수 있습니다 연결한 튜브에서).
- 모두 다음 단계는 얼음에서 수행되어야합니다. 메스 신선한 또는 스냅인 냉동 마우스 심장의 좌심실 해부. 참고,이 프로토콜은 마우스 마음에 최적화되어 있습니다뿐만 아니라 쥐 또는 사람의 마음에 맞게 할 수 있습니다. 또는 다른 종의에서 심장 조직의 1g까지 사용합니다.
- 때론 작은 큐비클로 표본을 트림.
- 용해 완충액의 15 ML 가득한 50 ML 팔콘 튜브에 조직 조각을 전송합니다.
- 를 Homogenize10 초위한 24,000 rpm으로 T-25 울트라 Turrax 프로브 균 질기 (이카)과 심장 조직.
- 30 ML에 용해 버퍼의 동일한 볼륨으로 homogenate를 희석.
- 더욱 조직과 무료 핵 homo....
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토론
cardiomyocyte 핵의 정확한 신원은 myocardium 2,3의 재생 과정의 분석을 위해 매우 중요합니다. 신선한 조직에서 cardiomyocytes를 분리하기위한 종래의 기술은 주로 세포외 기질 단백질의 소화 효소 및 저속 원심 분리에 의한 간질 세포에서 이후의 정화를 기준으로합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생활 cardiomyocytes의 자세한 정화는 같은 SIRPA 9 또는 mitochondrial 염료 10 표면 마커와 immunolabeling하여 수행할 수, 고정 cardiomyocytes 같은 마이 오신 중쇄 (MHC) 또는 같은 핵 단백질로서 세포질 마커에 의해 확인할 수 있습니다 GATA4 또는 Nkx2.5. 그러나, Nkx2.5과 GATA4의 표현은 성숙 cardiomyocytes에 국한되지 않고, 또한 개발 도중 심장 경색 11,12 후에 전구 세포에서 감지가 가능하다. cardiomyocytes을 식별하는 유전.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 유동세포계측법와 도움 마르셀 토로 인정 싶어요. 이 연구는 스웨덴어 심장과 폐 재단, 유럽위원회는 FP7 "CardioCell", 스웨덴어 연구 협의회, AFA 보험 및 ALF에 의해 지원되었다. OB는 도이치 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1. 용해 완충액 | |||
| 시약의 이름 | |||
| 0.32 M의 자당 | |||
| 10 MM 트리스-HCL (산도 = 8) | |||
| 5 MM CaCl 2 | |||
| 5 밀리미터 마그네슘 아세테이트 | |||
| 2.0 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | |||
| 0.5 MM EGTA | |||
| 1 ㎜ DTT |
| 2. 자당 버퍼 |
|---|
| 시약의 이름 |
| 2.1 M의 자당 |
| 10 MM 트리스-HCL (산도 = 8) |
| 5 밀리미터 마그네슘 아세테이트 |
| 1 ㎜ DTT |
| 3. 핵 저장 버퍼 (NSB 플러스) |
|---|
| 시약의 이름 |
| 0.44 M의 자당 |
| 10 MM 트리스-HCL (산도가 = 7.2) |
| 70 MM KCl |
| 10 밀리미터 MgCl 2 |
| 1.5 MM spermine |
| 시약 및 장비 | 회사 |
|---|---|
| Isotype 토끼 IgG 칩 학년, # ab37415 | Abcam |
| 토끼 반 PCM-1 항체, # HPA023374 | 아틀라스 항체 |
| 돈키 초. 항체, 안티 토끼 알렉사 488 형석, #-21206 또는 이와 동등한 초. 형광 항체 | 생명 기술 |
| DRAQ5 | Biostatus |
| 세포 strainers 30 μm의, 70 μm의 및 100 μm의 | BD Biosciences |
| 유리 douncer (40 ML)과"L"을 유봉 | VWR (Wheaton의 공업 주식 회사) |
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| 튜브 회전 | VWR |
참고문헌
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O.
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