쥐 신장 이식 후 급성 동종 이식 거부의 비 침습 이미징 사용<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

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방법 논문

쥐 신장 이식 후 급성 동종 이식 거부의 비 침습 이미징 사용

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DOI:

10.3791/4240

⸱

2013년 4월 28일

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 여기에서 비 침습적 18F-fluorodeoxyglucose와 양전자 방출 단층 촬영을 이용하여 급성 이식 거부 반응을 평가하기 위해 쥐의 신장 이식 모델을 제시한다.

초록

말기 신장 질환 환자의 수, 신장 이식 수혜자의 수는 지속적으로 증가한다. 급성 세포 동종 이식 거부 (AR)의 에피소드 장기 이식 생존을위한 부정적인 예후 인자이며, 적시에 진단 이식 기능 ¹ 중요합니다. 현재, AR은 확실히 침략 방법으로, 이식 부상 또는 손실이 상당한 위험을 드러낸다, 코어 생검에 의해 진단 할 수 있습니다. 또한, 생검은 AR이 초점 또는 누덕 누덕 기운 경우 위음성 결과를 초래할 수 있습니다 항응고제 약물과이 기술의 제한된 샘플링 사이트를 복용하는 환자에서 가능하지 않습니다. 결과적으로, 이것은 종종 다양한 이식 모델의 사용을 포함하여 동물에서 수행해야하는 새로운 AR 탐지 방법에 대한 지속적인 검색에 상승했다.

60 년대 쥐의 신장 이식 대해 조사를 위해 잘 확립 된 실험 방법이기 때문에AR ² ATION 및 분석. 또한 작은 동물 양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 동종 uninephrectomized 쥐의 신장 이식 모델에서 AR을 평가하고 비 침습, 특정의 새로운 옵션으로 이식 FDG-PET 영상을 제안하는 ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose (FDG)를 사용하여에 우리는 여기에 존재 인간의 상황을 ^3도 AR과 조기 진단. 또한,이 방법은 이식 거부 ⁴ 모니터링을 개선하기 위해 후속 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 기증자의 장기 복구

정위 현미경, 8-10 주 된 쥐 (기증자와받는 사람의 체중이 일치해야합니다)의 기록 중량을 설정합니다.
기증자 쥐 (루이스 브라운 노르웨이 F1, LBN F1)은 산소 / isoflurane을 흡입 (isoflurane을 4 % / 2 L / 분 산소)를 사용하여 마취. 2-2.5 %로 isoflurane을 낮추는 방법으로 마취를 유지합니다.
수술 패드에 마취 쥐를 놓습니다. 패드에 접착 테이프를 가진 쥐의 사지를 고정하고 쥐의 눈에 안과 연고 (Bepanthen, 바이엘)을 적용합니다.
면도 쥐의 복부를 소독하고 치골에서 간 꼬리 국경 복부 정중선 절개를 수행합니다. 주의 깊게 오른쪽으로 대장으로 이동하여 왼쪽 신장과 혈관을 노출합니다. 왼쪽 신장에 거즈의 얇은 시트를 배치하고 건조를 방지하기 위해 예열 등장 식염수로 적시십시오.
조심스럽게 (뒤몽 각도 팁 집게로 지방 조직을 해부 몬트 SS-45 집게 이녹스 의료, 파인 과학 도구, cat.no. 11203-25) 좌측 요관을 포위. 요관과의 직접적인 접촉을 피 대신에, 충분한 주변의 지방 조직으로 동원.
뒤몽 각도 팁 집게를 사용하여 신장 동맥에서 좌측 신장 정맥을 분리합니다. 두 선박의 모든 지방과 결합 조직을 제거하고 부신과 고환 혈관을 부식.
각각 왼쪽 신장 동맥과 정맥에 이상과 접합 아래의 대동맥과 하대 정맥 (IVC)를 해부하고, 모든 나가는 동맥을 부식.
장간막 동맥 근처에 최대한의 왼쪽 신장 동맥 위에 미세 클램프 (마이크로 Serrefines, 파인 과학 도구, cat.no. 18055-04)와 부신 대동맥 클램프. 수술 실크를 사용하여 infrarenal 대동맥 (5-0, Vömel, 예술 아니오. 14739) 왼쪽 신장 동맥 아래 약 5mm를 결찰.
수술 실크 infrarenal IVC (5-0, Vömel)을 결찰하고, 부신 IVC 클램프미세 클램프 (마이크로 Serrefines, 파인 과학 도구, cat.no. 18055-03).
좋은 가위 (- ToughCut 스트레이트 11.5 cm, 파인 과학 도구, cat.no. 14058-11 아이리스 가위)를 사용하여 가능한 한 가깝게 IVC에 신장 정맥을 잘라.
천천히 삽입하여 2 ㎖ 얼음처럼 차가운 HTK 관류 용액 (CUSTODIOL HTK, 프란즈 쾰러 케미)와 현장에서 신장을 붓는다 canula (Microlance 3 27G ¾, BD, cat.no. 302200) infrarenal 대동맥합니다. 확인하는 신장 색상 변경 (현재 올리브 색을 칠한).
먼저, 다음, infrarenal 대동맥 부신 대동맥을 절개하고 최대한 가까이 방광에 마지막으로 요관.
얼음 HTK 관류 용액에 요관 및 저장과 함께 신장과 혈관 공급 장치를 제거합니다.
혈관 클램프 및 마취 마음의 연속 절단을 제거하여 기증자의 쥐를 안락사.

2. 받는 사람 준비 및 이식을TION

정위 현미경, 쥐의 기록 중량을 설정합니다.
isoflurane을 4 %를 사용하여받는 사람 쥐 (루이스)를 마취. 2-2.5 %로 isoflurane을 낮추는 방법으로 마취를 유지합니다.
수술 패드에 마취 쥐를 놓습니다. 패드에 접착 테이프를 가진 쥐의 사지를 고정하고 쥐의 눈에 안과 연고를 적용합니다. 직장 온도 센서와 온난화 패드를 사용하여 모니터 및 제어 체온. 수술하는 동안 반복적으로 온도, 호흡과 동물의 심장 박동을 제어합니다.
면도 복부를 소독하고 치골에서 간 꼬리 국경 복부 정중선 절개를 수행합니다. 피부 외상을 최소화하기 위해 메스 forcutting에게 피부를 사용합니다. 오른쪽에 소장을 이동하여 왼쪽 신장과 혈관을 노출합니다.
조심스럽게 뒤몽 각도 팁 집게와 면봉을 사용하여 신장 캡슐을 제거합니다.
신장에 가까운 왼쪽 신장 동맥, 정맥과 요관을 막다수술 실 (4-0 Mersilene, ETHICON, 고양이. 아니. EH6732H)를 사용하여 두 ligations와 종자의 배꼽. 만 신장 종자의 배꼽을 떠나는 신장의 소비세 큰 부분. 면봉 잘라 표면을 청소하고 출혈을 확인합니다. 필요한 경우 다른 합자를 추가합니다.
조심스럽게 면봉 꼬리 사이트에 infrarenal 대동맥과 하대의 맥을 덮고있는 결합 조직을 통해 퉁명스럽게 해부.
뒤몽 각도 팁 집게를 사용 infrarenal 대동맥과 대정맥에서 눈에 띄는 신경을 분리합니다.
먼저 고환 혈관의 분기 아래에, 그리고 일반적인 장골 혈관의 분기 위의 두 번째 하나를 조심스럽게 두 2-4mm 길이 구멍을 형성 infrarenal 대동맥과 대정맥 사이의 결합 조직 시트를 해부. 사이 iliolumbar 동맥과 정맥을 부식.
두 구멍의 각을 통해, 하나의 수술 실 (ETHICON, 고양이 no.EH6665E. Mersilene 0)를 그립니다. 이 스레드 infrarenal 당겨 사용부드럽게 지느러미 사이트에 분기 혈관에 대한 액세스를 얻을 수있는 동물의 우측 대동맥과 대정맥. 두 구멍 사이의 이러한 혈관 중 하나를 부식하고 이후 수술 스레드를 제거합니다.
다음으로, 대동맥과 상 오프닝에서 시작하여 상부 개구부 (마이크로 Serrefines에서 대정맥으로 끝나는 개의 미세 클램프 (마이크로 Serrefines, 파인 과학 도구, cat.no. 18055-04)의 방향으로 응용 프로그램에 의해 대동맥과 IVC를 막다 , 파인 과학 도구, cat.no. 18055-03).
그 후 조심스럽게 피어스 바늘 대동맥의 고립 된 부분의 위쪽 끝 (Microlance 3 27G ¾, BD, cat.no. 302200)는 고급 스프링 가위 (Vannas 봄 가위의 아래쪽 블레이드를 삽입 - 3mm 블레이드, 미세 과학 천자 구멍을 통해 도구 cat.no 15000-00)과 짧은 세로 절개를 수행합니다. 남아있는 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 HTK 관류 용액으로 격리 된 대동맥을 세척합니다.
마찬가지로,주의 깊게 관통바늘로 대정맥의 절연 부분의 하단 끝은 천자 구멍을 통해 좋은 봄 가위의 아래쪽 블레이드를 삽입하고 곧 대동맥 절개 아래에 끝나는 세로 절개를 수행합니다. 다시 남아있는 혈액을 제거하는 용기를 세척하십시오.
스토리지 솔루션에서 신장 이식을 제거합니다. 왼쪽 신장의 이전 위치를 아래에 배치하고 방향이 올바른지 확인합니다.
이식 신장 동맥의 방향을 확인하고 꼬임이 없는지 확인합니다. 다음 이식에 거즈의 얇은 시트를 배치하고 냉각하는 얼음처럼 차가운 HTK 관류 솔루션을 적시고 건조를 방지 할 수 있습니다.
위의 첫 번째, 다음의 하단에 - 이식 신장 동맥 수술 실 (.. Ethilon 9-0, ETHICON, 고양이없이 2809G)와에 열립니다하는 대동맥 조각의 부신 부분의 구멍을 흥분시키는 대동맥 절개. 수술 스레드를 사용하여 연속 봉합 시계 방향으로 절개를 닫습니다(Ethilon 9-0), 뒤몽 각도 팁 포셉과 곡선 Castroviejo 바늘 홀더 (파인 과학 도구, 고양이. No. 12061-01). 그 후, 시계 반대 방향으로 두 번째 연속 봉합을 통해 결합 조직에 첫 번째 봉합사를 다룹니다. 지금 이식의 대동맥 부분 만 아래 부분 폐쇄 남아 있습니다. 정기적으로 얼음처럼 차가운 HTK 관류 솔루션 이식을 냉각.
봉합의 압박감과 무결성을 검증뿐만 아니라 이식에 남아있는 혈액을 제거 이식 대동맥 조각의 오픈 엔드에 삽입 무딘 바늘을 통해 얼음처럼 차가운 HTK 관류 용액 1 ㎖로 이식을 붓는다. 그 후, 수술 실크 대동맥 조각 (5-0, Vömel)의 열린 끝을 결찰.
이식 신장 정맥의 방향을 확인하고 꼬임이 없는지 확인합니다.
대정맥의 절개의 하단에 다음, 상단의 첫 번째 - 외과 실 (Ethilon 9-0)와 이식 혈관의 개통을 흥분시키는. 절개를 닫습니다수술 실 (Ethilon 9-0), 뒤몽 각도 팁 포셉과 곡선 Castroviejo 바늘 홀더를 사용하여 연속 봉합으로 시계 방향으로 돌립니다. 정기적으로 얼음처럼 차가운 HTK 관류 솔루션 이식을 냉각.
맨 대정맥 클램프로 시작, 미세 클램프를 제거 반대. 마지막 대동맥 클램프를 제거한 후 조심스럽게 면봉 결국 가벼운 출혈을 중지합니다. 몇 초 후에 이식은 장미 빛 착색 설정하고, uretric 수축이 나타납니다.
받는 사람`의 방광에 이식의 요관 삽입 신중 Vannas 봄 가위로 자른다 (학생 Vannas 봄 가위 직선, 파인 과학 도구, cat.no. 91500-09를 사용하여 방광의 상단에있는 근육의 작은 패치를 제거한다 ). 그런 다음 뒤몽 각도 팁 집게를 사용하여 이식 요관에서 주변 조직을 (주로 지방)를 제거합니다. 따라서 신중하게 요관의 끝을 잡고 조심스럽게 주변의 지방, 결합 조직을 분리하고 내장 혈관 아프로반대 방향으로 잡아 당겨 m. 수술 실 (Prolene으로 6-0, ETHICON, 고양이. No. 8697H)의 끝에 uretric 끝을 흥분시키는과 연결된 바늘로 방광의 이전 준비 상단을 관통. 방광을 통해 요관을 당겨 두 번째 천공을 통해 기지를 종료합니다.
수술 실 (Ethilon 9-0)와 방광의 상단에 조직을 분리 요관에서 이전을 흥분시키는. 첨부 외과 스레드와 요관의 끝을 잘라 조심스럽게 아래에서 밀어 방광에 다시 요관을 당깁니다. 그 후, 수술 실 (Ethilon 9-0)와 두 번째 방광 천자를 닫습니다.
수술 봉합 실 (Mersilene 0)를 사용하여 두 개의 연속하지만 별도의 봉합하여 복벽과 피부를 닫습니다. Pividon 요오드를 사용하여 상처를 소독하고 상처의 통증을 제어하기 위해 수술 후 3 일 동안 부 프레 노르 핀 (㎏ / BW / 입찰 당 0.1 밀리그램) SC를 관리 할 수 있습니다.

3. 영상 동종 이식 거부

isoflurane을 2-2.5 %를 사용하여 공복 쥐를 마취.
30 MBq FDG (0.1에서 30 MBq FDG ML 0.9 % 염화나트륨)는 24 G 카테터를 (브라운, Introcan, 4252500-01)를 사용하여 측면 꼬리 정맥을 catheterizing을 통해 IV를 관리하고 있습니다. 그 후, 0.9 ML 0.9 % 염화나트륨 용액으로 카테터를 제거.
시간당 0.9 % 염화나트륨 용액 1 ㎖의 정맥 주사로 스캔 수화물 동물의 시작할 때까지 마취없이 고정 장치에서 쥐를 남겨주세요.
스캔이 시작되기 전에 즉시 isoflurane을 2 %를 사용하여 다시 마취 쥐.
높은 해상도 마취 쥐를 놓고 멀티 와이어 챔버 기반의 동물 PET 카메라 quadHIDAC (옥스포드 양전자 시스템 주식 회사, 옥스포드, UK). PET 스캐너의 공간 분해능은 1.0 mm이며, 전체 FOV (직경 165 mm의 축 방향 길이 280 ㎜)에 상수이다. 펄스 맥박 산소와 직장 온도 센서 및 제어 마취를 사용하여 스캔하는 동안 모니터 및 제어 체온.
60m에 대해 동적 획득을 시작FDG의 신장 배설로 인해 신장의 추적 축적을 줄이기 위해 FDG 주입 후 180 분을 시작합니다.
신장 실질의 식별을 위해 ¹⁸ F-클리어런스 ^5의 계산을위한 스캐너에 쥐의 위치를 이동하지 않고 ¹⁸ F-불소 IV 5 MBq을 적용하고 60 분 후 즉시 ¹⁸ F-불소 주입 다른 PET 스캔을 수행합니다. 두 검사에서 이미지를 재구성. 2 분 신장 피질의 주위에 ¹⁸ F-불소 주입 (관류 상) 한 후 재구성 된 이미지를 수동으로 관심 볼륨 (VOI)을 추적하고 FDG의 이미지에 VOI를 전송합니다. 조심스럽게 VOI에서 신장 골반이 제외 된 금액입니다. 두 검사에서 이미지를 재구성하고 수동 신장 피질 주변 관심 볼륨 (VOI)을 추적. 목록 모드 데이터는 0.4 × 0.4 × 0.4 mm ³ 복셀 크기의 이미지로 재구성 하였다. 조심스럽게 VOI에서 신장 골반이 제외 된 금액입니다.
비 O 님의 FDG 섭취를 계산F 총 수와 볼륨 및 주입 용량 (% ID)의 비율을 계산합니다. 우리는 이미지 분석을위한 MATLAB (R2011b 버전, 매스 웍스, 틱, MA, USA)와 단층 영상 (TIM) 버전 2.8을 사용했다.