유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

Summary

우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을 제시 생체 내 wildtype 또는 T 세포 수용체 유전자 변형 배경에 유전자 조작 쥐를 사용합니다.

Abstract

건강한 면역 체계가 자기 항원에 허용 남아있는 동안 T 세포가 외국 항원에 반응해야합니다. T 세포 수용체 (TCR) α와 β loci의 무작위 다시 정리하기는 자신과 외국에 모두 항원 특이성의 광대 한 다양성과 T 세포 레퍼토리를 생성합니다. thymus에서 개발 중에 레퍼토리의 선택은 안전하고 유용한 T 세포를 생성 중요합니다. thymic 선택에 결함이 면역과 면역 결핍 장애 ^1-4의 발전에 기여하고 있습니다.

T 세포 progenitors은 CD4 또는 CD8 공동 수용체를 표현하지 않는 2 중 부정 (DN) thymocytes로 thymus를 입력합니다. αβTCR하고 두 공동 수용체의 표현은 '더블 긍정적 (DP) 단계에서 발생합니다. 자기 펩타이드-MHC (pMHC) thymic 세포에서 제공과 αβTCR의 상호 작용은 DP의 thymocyte의 운명을 결정합니다. 높은 연관성 상호 작용은 부정적인 선택과 elimina로 연결자기 반응성 thymocytes의 기. CD4 또는 자기 MHC ^(5)에 의해 제시 외국 항원을 인식 할 수 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) T 세포의 긍정적 인 선택과 개발에 낮은 친화 상호 작용 결과.

긍정적 인 선택은 성숙 T 세포의 생성을 관찰하여 polyclonal (wildtype) TCR의 레퍼토리와 마우스에서 공부 할 수 있습니다. 그러나, 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함 부정적인 선택의 연구에 적합하지 않습니다. 대부분의 모델 시스템은 부정적인 선택을 공부하지만, 생리 이벤트에게 ⁶ 요점을 되풀이하는 능력에 따라 다를하는 데 사용되었습니다. 외인성 항원의 행정 thymocytes ^7-9의 비 특정 삭제 될 수 있습니다 예를 들어, thymocytes의 체외 자극에 깊은 선택에 관여 thymic 환경을 부족합니다. 현재 생체 부정적인 선택에서 공부에 가장 적합한 도구 transg을 표현할 마우스 아르자기 항원 내생에 enic TCR의 특정. 그러나 많은 고전 TCR 유전자 변형 모델은 조기 부정적인 선택의 결과로, DN 단계에서 유전자 변형 TCRα 체인의 조기 표현을 특징으로하고 있습니다. 우리 연구소는 ¹⁰ wildtype 마우스에서 발생하는 부정적인 선택 SP 전환에 DP 동안 발생 할 수 있습니다 유전자 변형 HY TCRα이 조건 DP 단계에서 표현되는 HY의 ^{CD4 모델을} 개발했습니다.

여기, 우리는 HY의 ^{CD4 마우스} 모델에서 thymic 긍정적이고 부정적인 선택을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반의 프로토콜을 설명합니다. HY의 ^{CD4 마우스의} 부정적인 선택이 매우 생리이지만,이 방법은 다른 TCR 유전자 변형 모델에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 또한 유전자 조작 마우스에 적용 polyclonal 레퍼토리에 긍정적 인 선택을 분석하는 일반적인 전략을 제시합니다.

Protocol

실험 프로토콜의 전반적인 구조에 대해 1 그림을 참조하십시오.

1. 해부

1. 60 X 15mm 페트리 접시에 장소 무균 스틸 메쉬 화면. 하나의 단위 조직 샘플 당이 필요합니다.
2. 각 요리에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 5 ML을 추가합니다. 얼음 요리세요.
3. CO _2와 쥐를 안락사시켜야.
4. 분해 표면에 보안 마우스, 최대 직면하고 복부 쪽. 살균에 대한 70 %의 에탄올과 및 모피는 아래 헝클어되어 있는지 확인하는 스프레이 마우스.
5. 수술 가위를 사용, 그냥 성기 위의 복부 피부에 복부​​ 절개를하여 절개를 시작합니다. 턱에 절개 위쪽을 연장합니다.
6. 중간 선에서 모든 다리를 따라 절개를 확장합니다. 느슨한 피부를 당겨하고 분해 표면에 내려 핀.
7. thymus를 수확 :
   1. 절개을 할 수있는 흉골의 하단 끝을 들어 봐요.
   2. 간을 피 갈비를 분리하고 각 측면에 갈비를 절감 가로막을 잘라. 폐와 심장을 피하기 위해 관리하고, 각 쪽의 흉곽 위쪽으로 자른다.
   3. 흉곽을 다시 집게로 부드럽게 당긴다. t....

Results

생리 TCR 유전자 변형 모델 및 WT 생쥐에서 긍정적 인 선택 항원 만남 후 DP ^지루 무대로 이동하기 전에 DP ^밝은 단계에서 시작됩니다. DP ^무딘 thymocytes는 CD4SP 또는 CD8SP의 thymocytes (그림 2B)가되기 전에 과도기적 CD4 ⁺ CD8에게 ^이오 단계를 입력합니다. 성숙 SP의 thymocytes은 높은 TCR의 표현과 CD24 (그림 2C)의 손실을 특징으로하고 있습니다. 프로필은 CD69 또는 CD5으로 TCRβ을 검토, 긍정적 인 선택에 결함을 밝힐 수 CD4하여 CD8는 결함이 자리하고있는 곳으로 더 통찰력을 제공 할 수 있지만. CD69과 CD5 모두 이러한 마커 높은 표현을 유도하는 강한 상호 작용과 TCR의 자극 후 upregulated 있습니다.

CD69 음모에 의해 .......

Discussion

여기에 제시된 프로토콜은 비 TCR 유전자 변형과 TCR 유전자 변형 마우스의 양수와 음수 선택을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원의 착색에 대해 설명합니다. 분자 메커니즘의 추가 분석을 위해, 그것은 종종 세포 염색법을 수행 할 필요가 있습니다. 우리는 전사 인자 대부분의 세포 내 단백질과 BD Biosciences의 Foxp3의 얼룩 키트의 BD Biosciences Cytofix / Cytoperm 키트를 사용합니다. 우리는 보통 즉시 염색 후 우리의 샘플을 취득. 그러나, 샘플은 4에서 1 %의 포름 알데히드 ° 어둠 속에서 C로 FACS 버퍼에 밤새 저장할 수 있습니다. 일부 fluorochromes과 항체가 고정와 호환되지 않을 수도 있으니주의하십시오.

긍정적 인 선택의 분석을 위해, 우리는 부정적인 중급, 높은 표현 인구를보다 효율적으로 분리 (그림 2)를 제공 할 수 biotinylated 항 CD69 또는.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
HyClone 행크의 균형 소금 솔루션	열 과학	SH30030.02
금속 메쉬 화면	Cedarlane	CX-0080-E-01
배양 접시 (60 X 15mm)	피셔 과학	877221
주사기 (3 ML)	BD Biosciences	309657
원추형 튜브 (15 ML)	Sarstedt	62.554.205
현미경	Zeiss - 프리모 스타	415500-00XX-000
Hemocytometer	Hausser과학적인	3110
96 - 웰 플레이트	Sarstedt	82.1582.001
멀티 채널 피펫	Fisherbrand	21-377-829
태아 송아지 혈청	PAA	A15-701
인산염은 염분 버퍼	피셔 과학	SH3025802
나트륨 azide	IT 베이커 화학 (주)	V015-05
FcR 차단 시약			복제 2.4G2
안티 - 마우스 HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY의 *	복제 T3.70
안티 - 마우스 CD4	eBioscience	XX-0042-YY의 *	복제 RM4-5
nti 마우스 CD8α	eBioscience	XX-0081-YY의 *	복제 53-6.7
안티 - 마우스 CD24	eBioscience	XX-0242-YY의 *	복제 M1/69
안티 - 마우스 TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY의 *	복제 H57-597
안티 - 마우스 CD69는 Biotinylated	eBioscience	13-0691-YY *	복제 H1.2F3
안티 - 마우스 CD5는 Biotinylated	eBioscience	13-0051-YY *	복제 53-7.3
Streptavidin	eBioscience	XX-4217-YY의 *
흐름 cytometer	BD Biosciences - FACS 캔토	338962
FACS 튜브	BD Biosciences	352052
유동 세포 계측법 분석 소프트웨어	TreeStar - Flowjo	FlowJo V7 / 9
HyClone RPMI - 1640 미디어	열 과학	SH30027.01
			fluorochrome와 YY는 유리 병의 크기에 따라 다릅니다에 의해 * XX는 다릅니다.