이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
조직 - 엔지니어링 소장 (TESI)가 성공적으로 40일 이내에 수술 전 근력로 돌아 발생, 거대한 작은 창자 절제술 후 루이스의 쥐를 구출하는 데 사용되었습니다. 인간 1, 대규모 작은 창자 절제술 짧은 창자 증후군, 기능 malabsorptive이 발생할 수 있습니다 중요한 병적 상태, 사망률, 그리고 비경 영양 의존도, 간 장애 및 간경변, 그리고 multivisceral 장기 이식의 필요성 2.이 문서에 포함 의료 비용을 수여 국가는, 우리는 마우스 모델에서 조직 - 엔지니어링 소장을 만들기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 문서화 다세포 organoid 단위 온 발판 방식으로. Organoid 단위는 점막과 중간 엽 모두 요소를 포함하는 장에서 파생 다세포 집계, 3 장 줄기 세포 틈새 시장을 유지하는 사이의 관계입니다. 지속적인와 미래의 연구에서 4로 우리 기술의 전환마우스는이 종에서 사용할 수있는 유전자 변형 도구를 이용하여 TESI 형성하는 동안 관련된 프로세스의 조사를 허용합니다. 면역 저하 마우스 종자의 5 가용성도 우리 인간의 장 조직에 기술을 적용하고 같은 인간 TESI의 형성을 최적화 할 수 있도록 허용합니다 인간에의 전환하기 전에 마우스 이종 이식. 우리의 방법은 좋은 제조 연습 (GMP) 시약 및 이미 인간의 환자에 사용하기 위해 승인, 따라서 decellularized 동물의 조직에 의존 접근 방식에 비해 상당한 장점을 제공 한 자료를 사용하고 있습니다. 이 방법의 궁극적 인 목표는 짧은 창자 증후군의 재생 의료 치료 전략으로 인간의 번역입니다.
프로토콜
1. Organoid 단위 준비
- 마우스 해부 (가위와 집게)에 적합한 악기 압력솥의 소독을해야합니다.
- 편안하게 지역 IACUC 프로토콜에 따라 기증자 마우스를 안락사시켜야. 동물이하기 전에 죽은 있는지 확인합니다.
- 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 중간 선 절개를합니다. 노출을 개선하기 위해 필요에 따라 피부 플랩이 반영 될 수 있습니다.
- 작은 창자를 창자를 빼내다와 Treitz의 인대에 단지 말초을 나눕니다. 샤프하고 부드러운 무딘 절개를 사용하여 장간막에서 작은 창자를 분리합니다. ileocecal 접합을 파악하고 이에 대한 근위 작은 창자 5mm를 나눕니다.
- 가위를 사용하면 (Invitrogen, 안티 - 안티) 10 ML 4 ° C, 멸균 행크스 '버퍼 생리 (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X 항생제 - 항 곰팡이를 배양 접시에있는 antimesenteric 국경을 따라 길이 솔루션을 장을 엽니 다. 로 연 장에서 대변을 해제합니다부드러운 교반 한 다음 10 4의 ML ° C, 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티을 15ml 원심 분리기 튜브로 열린 장을 전송하기 만하면됩니다.
- 4 10 ML에 열려있는 장을 세 번 씻어 ° C, 테스트 튜브....
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결과
그림 1은 여기에 설명 된 프로토콜에 대한 전반적인 스키마를 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 결과는 동일한 구조를 표시하는 루멘, 점막, submucosa, 그리고 muscularis. 그림 2A를 둘러싼 것은 시작 폴리머 비계. 그림 2B에 비해 전형적인 세계를 보여줍니다과 조직 - 엔지니어링 손쥐 소장의 세계 또는 구형 구조입니다 급의 루멘을 나타 내기 위해 bivalved. 그림 3은 부화 후 4 주 후 전형적인 성공적인 구조의 hematoxylin / eosin-스테인드 파라핀 장착 단면을 보여줍니다. 참조합니다. 4, 우리는 (44 임플란트 39 개) 시간의 조직 - 엔지니어링 소장 성공적으로 89 % 생산 할 수 있었다.
실패 구조는 진행하지 점막 양식입니다. 그것은 전 세계 최종 histologic 분석 점막을해야합니다 여부를 수확에서 총 모양.......
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토론
우리는 organoid 단위 온 발판 접근 방식을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 가장 중요한 단계는 organoid 단위의 준비가 일반적입니다. 주의 적절하게 청소하고 기계적으로 조직을 처리하는 이동해야하지만 소화를 수행 한 후에 동일한주의 (단계 1.11) organoid 단위를 overdigest 또는 overtriturate하지 않도록해야합니다. 이 작업을 수행하는 경우, organoid 단위 단계 1.12의 표면에 뜨는에서 손실 될 수 단일 세포로 감소하고, 조직 - 엔지니어링 소장을 생산 살아남을 가능성이 될 수 장 줄기 세포 틈새로 보존되지 않을 케이스.
마우스의 작은 사이즈는 직접 생체에 그 기능을 테스트하기 위해 호스트 동물의 창자에 조직 - 엔지니어링 구조를 합한다 어렵습니다. 또는 쥐가 생체 문합에 용이하게 TESI의 성장을 위해 더 큰 모델을 대표하고이미 이런 이유로 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
트레이시 C. Grikscheit, 에릭 R. Barthel, 그리고 글쓴이 G. 살라은 캘리포니아 재생 의료 연구소 (CIRM), 교부금 번호 RN2 - 00946-1 (TCG)과 TG2-01168 (ERB, FGS)에 의해 지원됩니다. 앨리슨 L. Speer은 대학 외과 전문의 Ethicon 학자의 사회입니다. Yashuhiro Torashima는 어린이 병원 로스 앤젤레스 Saban 연구소 연구 경력 개발 친목으로 운용되고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| 항생제 - Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase의 타입 1 | 워싱턴 | LS004194 | |
| DMEM 높은 포도당 1X | Gibco | 11995-065 | |
| 열 inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 백퍼센트 PGA | Concordia는 의료 | FELT01-1005 | 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오.4 |
| 폴리-L-락트산 | Durect | B6002-1 | 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 |
| I 콜라겐, 쥐 꼬리 입력 | 시그마 - 알드리치 | C3867-1VL | 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 |
| 케토 프로 펜 100 MG / ML | 요새 닷지 동물 건강 | 71 - KETOI - 100-50 | |
| LabDiet 5,001 쥐 급식 | LabDiet | 5001 | |
| 5 ML, USP 당 Septra 200 밀리그램 / 40 밀리그램 | 하이테크 Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | 피닉스 제약 | 57319-507-06 |
참고문헌
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem....
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