Method Article

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

DOI:

10.3791/4286

⸱

November 25th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시력의 손실이 미국에서 약 3,400,000명에 영향을 미치는 향후 몇 년간 증가 할 것으로 예상된다. 최근 1 유전자 치료와 줄기 세포 transplantations는 망막 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료에 키 치료 도구가되었습니다. 이러한 홍채 색소 상피 세포 이식 등 연령 관련 황반 변성에 대한 autologous 이식의 여러 형태 (AMD)는 놀라운 결과를 생성하고, 인간의 임상 실험은 유전자와 줄기 세포 요법의 다른 형태에 시작했습니다.이 이는 RPE65 유전자 교환을 포함 Leber의 선천성 amaurosis과 Stargardt의 질병에 인간 배아 줄기 (ES) 세포를 사용하여 RPE 세포 이식 환자에서 치료. 3-4 이제 유전자 치료 벡터 및 망막 질환으로 환자를 치료에 사용할 수 줄기 세포가, 그걸 확인하는 것이 중요합니다 동물 모델에서 이러한 잠재적 인 치료 전에 적용인간의 연구에서 그들을 들죠. 마우스가 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포 이식의 치료 효능을 테스트하기위한 중요한 과학적 모델이되었습니다.이 동영상을 문서에 5-8, 우리는의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포를 주입 할 수있는 기술을 제시 마우스 눈 주변 조직의 손상을 최소화하면서.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Subretinal 사출을위한 장치 조립

  1. 구입 또는 유리 모세관에서 100 μm의 직경 바늘을합니다. 이것은 셔터 P-97 pipet을 끌어 당기는 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가 원하는 직경 (100 μm)에 도달 할 때까지 모세관 튜브의 끝을 가열하여 가져온 것입니다. 작은 직경 바늘은 유전자 치료 벡터에 사용 할 수 있지만,이 셀 또는 눈에 손상없이 세포 분사에 대한 권장 직경입니다. 강철 바늘에 비해 유리 모세관 바늘이 망막 파손의 원인이없이 주입 유체 및 subretinal 공간에 액세스 시각화를 위해 허용하는 아주 좋은하지만, 무딘 팁을 가지고 있습니다. 멸균 용기에 70 %의 에탄올 및 저장을 사용하여 필요한 경우이 당겨 바늘을 청소하십시오. 장소에 바늘을 가질 테이프 15cm 무균 조직 배양 접시에 주입 바늘이 적용하고 무균 환경에서 유지하는 방법 중 하나입니다. 이 시점에서, compl프로 시저가 개최됩니다 외과 객실 내에서 설정을 어서!. 그것은이 절차는 장벽 시설 내에서 수행됩니다 특히,이 무균 상태로 유지 될 수 있도록 항상 수술 방에 모든 장비를 유지하기 쉬운 것입니다.
  2. 주입 바늘에 실리콘을 기음과 바늘의 내부 벽을 따라 코팅을 떠나 실리콘를 꺼냅니다. 실리콘 코팅 달리 내부 유리 모세관....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 눈의 그림을 intravitreal와 subretinal 모두 주입 수술 절차 (화살촉, 그림 1)의 위치를 표시하는 화살표로, 참조 표시 주요 구조로 표시됩니다. 예를 lacZ lentiviral 벡터 (그림 2)와 같은 유전자 치료 벡터는 이러한 위치를 사용하여 주입 할 수 있습니다. 또한, 이러한 마우스 배아의 줄기 세포 (그림 3)과 같은 줄기 세포는 또한 마우스 눈이 사이트에 이식 할 수 있습니다.

사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 발기인 (1x10 8 TU / ML, Lentigen 공사, 그림 2A)에 의해 구동 lacZ의 리포터 유전자를 갖고 lentiviral 벡터의 1 μl은 C57BL/6J 마우스의 subretinal 공간으로 주입되었다. 눈이 무딘 절개로 세 6 주에 enucl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오 기술은 성공적으로 subretinal 주입 수술 절차를 완료하고, 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포가 효율적으로 안과 질환을 치료하는 데 필요한 위치에 배치됩니다 있도록에 대한 지침을 제공합니다. 이것을 세포의 주변에 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포 유래 조직을두고 있기 때문에이 기술은, 이러한 RPE 또는 photoreceptors과 같은 망막 세포의 타겟팅 할 수 있습니다. 이전 방법은 유체가 유리 캐비티 내에 위치 intravitreal 주사를 포함하고 이러한 특정 지역을 타겟팅하기 위해 망막을 통해 마이그레이션해야합니다. Intravitreal 주입은 대상 photoreceptors 또는 RPE가 아닌부터 모든 바이러스 입자가 올바른 위치에 마이그레이션되는 유전자 치료 벡터의 전달을 감소시킨다. 또한, 줄기 세포는 병에 걸린 RPE 또는 photoreceptors을 대체하기가 점점 인기를 끌고 있으며, 이러한 차별화 된 세포는 하위 내 이식해야합니다망막 공간 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

타카유키 나가사키에서 실험 지원; 실명 방지를위한 조사이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다. KJW는 NIH 보조금 5T32EY013933 및 5T32DK007647-20에 의해 지원됩니다. VBM은 NIH 보조금 K08EY020530에 의해 지원됩니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
이름 회사 목록 코멘트
0.8-1.10 X 100mm 모세관 (유리) 킴블 유리 주식회사 34,502 99
/ 브라운 Micropipette 풀러을 불타는 셔터 악기 P-97 Narishige microforge 대신 사용할 수 있습니다. 카탈로그 # MF-900
Sigmacote 시그마 알드리치 SL2-25ML 실리콘
Dubecco의 인산은 칼슘 염화물과 마그네슘 염화물과 식염 버퍼 Gibco-Invitrogen 14040-133
안전 - 무사히 다녀 오게 25 3/4G X 12 ", 혈액 컬렉션 세트 BD Vacutainer 367298
한 ML 하위 Q 265/8G 슬립 - 팁 주사기 Becton - 디킨슨 309597
0.5-10 μl Finnpipette II 조정 - 볼륨 Pipetter Fisherbrand 21-377-815
1-200 μl 자연 Beveled 팁 미국 과학 주식회사 1111년에서 1700년까지
Discovery.V8 스테레오 현미경 Zeiss MC1500
60mm X 15mm 스타일 치료 폴리스티렌 세포 배양 접시 코닝 주식회사 430166
Vannas 스트레이트 가위 Storz Ophthalmics E3383 S
정교한 톱니 모양의 곡선 드레싱 포셉 Storz Ophthalmics E1408
15도 미세 나이프 Wils안과 주식회사에 091204
케타민 Ketaset III 나다 # 45-290
Xylazine 로이드 연구소 나다 # 139-236
Bupivacaine (Marcaine) 아스트라 제 네 카 N / A
Buprenorphine 시그마 알드리치 B9275

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Subretinal InjectionGene Therapy VectorsStem CellsMouse EyeSclerotomy TechniqueGlass Capillary NeedleFluid InjectionBack PressureSubretinal SpaceRetinal Pigment Epithelium

Related Articles