을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적<em&gt; E. 대장균</em

Ming Jiang; Haoran Zhang; Blaine A. Pfeifer

doi:10.3791/4346

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방법 논문

을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적

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DOI:

10.3791/4346

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2013년 1월 13일

Ming Jiang¹ , Haoran Zhang² , Blaine A. Pfeifer¹

¹Chemical and Biological Engineering Department, State University of New York at Buffalo, ²Chemical Engineering Department, Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

을 통해 에리스로 마이신의 heterologous 생합성 E. 대장균 다음 실험 단계가 포함되어 있습니다. 각 단계는 사용하는 치료 천연 제품을 생산 동기 부여, 잠재적 인, 그리고 도전의 맥락에서 설명 될 것이다 E. 대장균 대리 호스트로.

초록

복잡한 자연 제품의 heterologous 생산은 현재 한계와 미래의 가능성을 해결하기위한 방법이다. 이 치료 가치를 가지고 있지만 충분히 생산 또는 생산의 개선 양식에서 도움이 될 수 없습니다 그 화합물에 특히 유용합니다. 2) heterologous reconstitution, 그리고 3) 제품 분석 1) 유전자 송금 : 관련 실험 절차는 세 가지 구성 요소로 세분화 할 수 있습니다. 각 실험 요소는 도전을 극복하고이 새로운 접근 방식과 관련된 기회를 예상 할 수 지속적인 최적화 아래에 있습니다.

Heterologous 생합성는 귀중한 자연 제품에 대한 책임 유전자 시퀀스의 식별로 시작합니다. heterologous 호스트에이 시퀀스를 전송하는 것은 제품의 형성에 대한 책임 biosynthetic 경로의 복잡성에 의해 복잡합니다. 항생제 에리스로 마이신은 좋은 예입니다. 스물 유전자 ()> 50킬로바이트 총은 결국 생합성 필요합니다. 또한,이 유전자의 세 크기는 megasynthases, 멀티 도메인 효소 각 ~ 300 kDa을 인코딩합니다. 이 유전 물질을 설계 및 E.로 이동해야합니다 재구성 생합성에 대한 대장균. PCR 절연, 오페론 건설, 멀티 cystronic plasmids 및 전기 변환의 사용은 에리스로 마이신에게 E.에 대한 유전자 클러스터를 전송하게 설명 될 것이다 대장균.

일단 양도, E. 대장균 세포는 결국 생합성을 지원해야합니다. 이 과정은 또한 E. 사이의 상당한 차이를 주어 도전합니다 대장균과 복잡한 자연 제품의 형성에 대한 책임 대부분의 원본 호스트. 세포는 생합성을 지원하기 위해 필요한 기판을 제공하고 coordinately 활성 효소를 생성하기 위해 전송 유전자 클러스터를 표현해야합니다. 에리스로 마이신 A, E.의 경우 대장균 세포는 두 전구체을 (PR 제공 할 수 있도록 설계해야했습니다opionyl-COA 및 (2S) - methylmalonyl-COA)은 생합성에 필요합니다. 또한, 유전자 시퀀스 수정, 플라스미드 복사 번호, chaperonin 공동 표현, 사후 병진 효소 수정, 및 프로세스 온도는 최종 에리스로 마이신에게 형성 할 수 있도록해야했다.

마지막으로, 성공적인 생산은 평가해야합니다. 에리스로 마이신 경우를 들어, 우리는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)가 생산을 확인하고 정량화하는 것입니다. 에리스로 마이신의 bioactivity는 또한 항생제 활동이 세균의 subtilis에 대한 테스트되는 bioassay의 사용을 통해 확인합니다. E.에서 에리스로 마이신을 설정 평가 assays는 생합성 생산을 향상 다양 화하는 미래의 엔지니어링 노력이 접근 방식을 사용하여 새 복잡한 자연 화합물의 생산을위한 무대를 대장균 등을 설정합니다.

서론

에리스로 마이신은 그람 양성 토양 세균 Saccharopolyspora erythraea에 의해 생산 polyketide 항생제이며, 현재의 생산은 점차적으로 전통적인 mutagenesis 및 검사 프로토콜의 수십 년을 통해 그리고 더 최근의 프로세스 최적화를 구성 ^1-6으로 ~ 10g / L로 향상되었습니다. Mutagenesis 및 심사 전략은 배양 및 / 어려움의 결과로 또는 유전자 원시 생산 호스트를 조작하고 있기 때문에 즉시 사용할 수 항생제 활동이나 선택을 돕기위한 개선 된 성장 phenotypes의 항생제 천연 제품 개발에 일반적입니다. 에리스로 마이신 A, S.의 경우 erythraea의 생산과 새로운 파생 상품의 생합성에 빠른 개선을 hampering, 따라서 속도가 느린 성장 프로필과 더 직접적인 유전자 조작 기술의 부족 (대장균과 같은 미생물에 비해)에 의해 제한됩니다. 생산 문제를 인식하고 diversificati을 해제 갖는에리스로 마이신과 같은 화합물과 가능성에 연구 커뮤니티는 heterologous 생합성 (그림 1) ^7의 아이디어를 추구하기 시작했다. 이러한 노력은 에리스로 마이신 유전자 클러스터 ^8-11에 사....