게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

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방법 논문

게놈 전체 유전자 삭제할에

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⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

2012년 11월 23일

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는 설립되었습니다 연쇄상 구균 sanguinis 모델 생물로. 이 방법은 높은 처리량 재조합 PCRs 및 변환을 통해 달성했다.

초록

Transposon mutagenesis 및 단일 유전자 삭제 박테리아 ^1,2의 게놈 전체 유전자 녹아웃에 적용된 두 가지 방법이 있습니다. transposon의 mutagenesis이 적은 시간이 소요 적은 비용이 많이 드는, 그리고 완성 된 게놈 정보를 요구하지 않습니다하지만,이 방법은 두 약점이 있습니다 : 감소 경쟁과 뮤턴트 카운터 선택하는 혼합 돌연변이 라이브러리의 서로 다른 돌연변이 (1) 가능성, (2) 일부 유전자 불 활성화의 가능성은 상기 유전자가 완전히 transposon의 삽입에 따라 자신의 기능을 잃게하지 않습니다. 단일 유전자 삭제 분석 transposon의 mutagenesis와 관련된 단점을 보완 할 수 있습니다. 게놈 전체의 단일 유전자 삭제의 효율성을 개선하기 위해, 우리는 모델 생물로 연쇄상 구균의 sanguinis를 사용하여 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 대한 높은 처리량 기술을 확립하려고합니다. 각 유전자 삭제 S.에 구축 sanguinis 게놈는 1을 구성하도록 설계되었습니다타겟 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 단백질, 그리고 타겟 유전자의 1 이하 하류-KB 상류. 프리 머 F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트를 각각 설계, 각 삭제 그 세 가지 구성 요소 구성의 PCR-amplifications을위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 합성됩니다. 프리 머 R1과 F3는 5 '끝 부분에있는 aphA-3 유전자의 지역에 보완 25 BP 시퀀스가 포함되어 있습니다. aphA-3 유전자의 대규모 PCR 증폭은 모든 단일 유전자 삭제 구조를 만드는 한 번 수행됩니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 처음 kanamycin 카세트의 잠재력 극성 효과를 최소화하기 위해 제외됩니다. 유전자 삭제 구조를 만들려면, 높은 처리량 PCR의 증폭 및 정화는 96 - 웰 플레이트 형식으로 수행됩니다. 각 유전자 삭제에 대한 선형 재조합 PCR의 amplicon는 고 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 네 PCR 반응을 통해 구성됩니다. 초기 exponS.의 ential 성장 단계 2.5 % inactivated 말 혈청이 PCR-재조합 구조의 변화에 대한 능력을 향상하는 데 사용됩니다와 토드 휴이트 국물에 배양 sanguinis이 보충. S.의 조건, 최대 20 % sanguinis 세포는 DNA의 ~ 50 NG를 통해 변환 할 수 있습니다. 이 방법에 따라, 단일 유전자 삭제로 2048 뮤턴트은 궁극적으로 S.에있는 2,270 유전자에서 얻은되었습니다 네 유전자 ORFs 제외 sanguinis은 S.의 다른 ORFs 내에 완전히 포함 sanguinis SK36 218 가능성이 필수적인 유전자. 유전자 삭제 구조를 만드는 방법에 대한 기술은 높은 처리량이며, 모든 transformable 박테리아 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 사용하기 쉬운 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 프라이머 디자인

프리 머은 S.에 따라 집 스크립트에서 사용 설계되어 있습니다 sanguinis SK36 게놈 시퀀스. 프리 머, F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트 대상 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 (km ^R) 단백질 ⁽³⁾ 및 (1)의 1 킬로바이트 상류 시퀀스의 증폭을 위해 설계되었습니다 각각 대상 유전자의-KB 하류 순서 (그림 1). 이러한 프리 머 가운데 F1 및 R3는 프로그램의 양각 스위트 룸 (에 ePrimer3를 사용하여 설계되었습니다 http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html 대상의 상류 또는 하류 측면을 노릴 지역을 확대하려면) 유전자. 유전자 특정 프리 머, R1 및 F3는 5 '와 3'대상 유전자의 시퀀스에 따라 설계되었습니다. R1과 F3 프리 머의 aphA-3에 보완의 5 '끝에서 25-BP 어댑터 시퀀스를 포함유전자. 각 프라이머의 녹는 온도는 가장 가까운 가능한 60 ° C 96 - 웰 형식의 모든 PCR 반응에 대한 온도를 어닐링 유니폼의 사용을 활성화 할 수 있습니다. 할 수 있도록 설계되었습니다
F1, R1, F3 및 R3 프리 머은 유전자 순서에 따라 96 - 웰 플레이트에 합성됩니다. 각 판은 동일한 유전자 순서 프리 머의 한 종류가 포함되어 있습니다. 채널 피펫을 사용하여 PCR 증폭을위한 10 μm의 최종 농도로 96 - 웰 작동 프라이머 판에서 프리 머를 희석.

2. 높은 처리량 PCR 증폭 및 정화

높은 처리량 증폭하려면 1 킬로바이트 상류 또는 대상 S.의 하류 sanguinis의 유전자는 1640 μl ddH ₂ O, 250 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 200 μl, 50 MM 100 μl MgSO _4, 100 μl를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 얼음에 PCR 칵테일 혼합을 조립 10 μl / NG S. sanguinis SK36 게놈의 DNA와 10 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매 DNA polyme새기다 고 충실도 및 전송 채널 피펫을 사용하여 96 - 웰 PCR 플레이트의 각도에 혼합물의 23 μl. 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트에 프라이머 플레이트 작업 10 μM에서 각각 F1과 R1 (또는 F3와 R3) 1 μl를 전송합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 1.5 분 30 초 및 68 ° C에 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 54 ° C에 94 ° C에서 증폭을 수행합니다.
1퍼센트 아가로 오스 겔 48 우물 피팅 멀티 채널 피펫 로딩과 ethidium 브로마이드를 포함하는 준비. 96 - 웰 플레이트에 5xDNA 로딩 버퍼 1 μl를 갖춘 4 μl PCR 제품을 섞어서 10 μl 다 채널 피펫을 사용하여 아가로 오스 겔에서 샘플을로드합니다. 30 분에 135 V의 전기를 실행합니다. UVP 문서 및 분석 체제에서 젤에 밴드를 검사합니다.
제조업체의 지시에 따라 원심 분리를 사용하여 PureLink 96 PCR 정화 키트하여 PCR 제품을 정화. DNA를 용출를 들어, B의 잘 40 μl 멸균 ddH ₂ O를 추가 할판을 inding.
무작위로 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 검사하기 위해 접시에 몇 정화 amplicons을 선택합니다. 접시에 amplicons의 농도를 조정하려면 ~ μl / 10 NG.
플라스미드 포함 킬로미터 ^{연구 카세트는} PCR 템플릿으로 EcoR I을 사용하여 소화하고 있습니다. 소화 플라스미드는 QIAquick PCR 정화 키트에 의해 정화되고 선형 플라스미드 DNA는 최종 DNA 농도로 10 NG / μl를 조정됩니다. SO 16.4 μl ddH ₂ O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함 킬로미터 ^{연구 카세트} amplicon 25 μl 혼합물을 조립 _4, 10 μM F2, 1 μl 1 μl 10 μM의 R2, 1 μl 선형 플라스미드 DNA와 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 고 충실도. ° C 1 분 30 초 68 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 55 ° C에 94 ° C에서 PCR 증폭을 수행합니다. 1퍼센트 아가로 오스의 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 검사합니다. 푸QIAquick PCR 정화 키트로 10 개인 PCR 정화의 km ^{R 카세트} amplicon의 라 일괄. 10 NG / μl로 amplicon 농도를 조정합니다.
최종 선형 재조합 PCR의 amplicon을 구하려면 세 PCR의 amplicons은 잘 PCR 템플릿과 같은 하나 PCR 플레이트의 각 1 μl (거의 동등한-몰 양에서)과 결합되어 있습니다. 다른 PCR 구성 요소는 SO 14.4 μl ddH ₂ O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함한 추가됩니다 _4, 10 μM의 F1 1 μl, 10 μM R3의 1 μl, 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 높은 충실도를. PCR 증폭은 4 분에 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 30 초 및 68 ° C 30 초 55 ° C에서 2 분, 94의 30주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다.
아가로 오스 겔에서 PCR amplicons를 검사합니다. 정화하고 위에 설명 된대로 PCR의 amplicons을 수량화. -20 ° C.에서 재결합 PCR의 amplicons를 고정

3. COMpetent 셀 준비

토드 휴이트 국물이 준비되어 상온으로 냉각 및 0.22 μm의 폴리스티렌 필터 ^4를 사용 소독 한 후 끓여야하고 가열 10 N NaOH를 사용하여 7.6로 조정 산도. TH + HS 매체를 만회하기 위해 15 ML 원뿔 튜브에 11.7 ML 토드 휴이트 국물에 300 μl 열 inactivated 말 커를 (2.5 %까지 최종 농도)를 추가합니다. 나누어지는의 TH + HS 중간이 ML 튜브 10 ML에.
주식 S. 5 μl의 예방 sanguinis SK36 2 ML의 TH + HS 매체에 -80 ° C에서 냉동 37에 단단히 상한과 밤 문화를 길러 10 ML-TH + HS 관을 미리 잠복기와 함께 ° C,.에게
박 한 후, 10 ML TH + HS에 50 μl 문화를 전송하고 3 시간 (0.07-0.08의 OD _660에 해당)를 37 ° C에서 관을 길러 즉시 변환을 위해 사용합니다.

4. 셀 변환과 항생제 선택

70 NG S. 2 μl를 추가합니다 sanguinis SK36 competence 자극 펩타이드 (CSP)과 37 번 블록 96 - 웰하고 사전에 따뜻한에서 Eppendorf 튜브 2 μl 선형 재조합 PCR amplicon (~ 50 NG) ° C. 각 튜브에 3 시간 - incubated SK36 문화의 330 μl를 전송합니다. 1 시간에 37 ° C에서 알을 품다. 제어 등의 살균 ddH ₂ O와 DNA를 교체하십시오.
얼음 블록을 놓고, 500 μg / ML의 kanamycin과 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트의 각 변형 100 μl을 알리십시오. microaerobic 조건 하에서 2 D에 37 ° C에서 접시를 품다.

5. 돌연변이 확인 및 저장

각 교체 돌연변이를 들어, 무작위, 2 개인 식민지을 데리러 오 ML BHI가 500 μg / ML의 kanamycin을 포함하는으로 식민지의 예방 및 37에서 microaerobically 밤 inoculum을 품어 ° C. -80에서 30 % 글리세롤에있는 각 문화를 Cryopreserve ° C
예상 유전자 교체를 포함하는 돌연변이가 식민지 각 돌연변이 사용하는 F1에 대한 PCR 및 R3을 수행 여부를 검사하려면96 - 웰 PCR 판에서 프리 머. 개별 식민지에서 약 1 μl 밤 문화는 25 μl PCR-증폭 반응에서 DNA 템플릿으로 사용됩니다. PCR는 ° C 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 4 분에 30 초 및 68에 30 초, 55 ° C에 5 분, 94의 35주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다.
정확하게 이중 대역 돌연변이 나 오염 물질 PCR의 amplicon을 확인하려면 ethidium의 브로마이드 착색과> 12cm 길이 2% 아가로 오스 겔에서 4 시간에 전기 영동하여 PCR amplicon을 확인합니다. 이 아가로 오스 겔 전기 영동 조건에서 ≥ 100 BP의 차이가있는 모든 amplicons은 분명하게 식별되었습니다. km의 ^{R 카세트의} 증폭 및 야생 형 유전자에서 발생하는 밴드는 내부 T1의 프라이머는 야생 형 유전자는 PCR에 의해 검출 될 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다 <100 BP에 의해 차이가 예상하는 경우.
추가로 삭제를 확인하려면 amplicons는 PureLink 96 PCR 정화 키트에 의해 정화되고있는 P1의 프라이머를 사용하여 순서가 아르km의 ^{R 카세트에} 바인딩합니다. 시퀀싱에 의해 확인 만 정확한 돌연변이세요.