방법 논문

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

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DOI:

10.3791/4357

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2014년 9월 29일

 ,  ,  , 
1Penn Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

초록

우리는 생쥐에서 심방 부정맥 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 우리가 신생아 쥐의 심근 세포를 분리하기 위해 설계된로부터 유도 된 마우스의 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 더 광범위한 패치 클램프 또는 생화학 적 연구에 적합한 건강 심장 멜라노를 얻기 위해, 우리는 단리 및 원래 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된 이들에 기초하여 심장 멜라노 도금을위한 정제 과정을 개발 하였다. 정제 과정이 리뷰에서 설명하고 순수한 인구 또는 심근으로 도금 할 수있다 건강한 멜라닌 세포와 같은 세포의 큰 숫자를 생산하고있다.

서론

우리는 최근 멜라닌 합성 효소를 표현하고 형태 학적으로 피부 멜라닌 세포를 닮은 쥐와 인간의 심장에 새로운 세포 인구를 확인했다. 우리는이 세포의 멜라닌 세포를 심장 '이라고하고 심방 부정맥은 종종 인간에서 발생 트리거되는 해부학 적 위치에 있습니다 발견했다. 우리는 또한 심장 멜라닌 세포는 DCT의 생식 세포 삭제와 생쥐에서 심방 부정맥에 기여했습니다. 심장 멜라노가 띄엄 그들은 모두 심방 세포의 0.1 % 미만을 포함 할 마우스 심방에 걸쳐 분산된다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 Cre 호텔 유도 멜라닌 세포 특정 마커를 사용하여 마우스 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 당초 절차는 신생아 쥐의 심근 및 패치 클램프 기록 또는 PCR 분석에 적합한 세포의 수득 매우 작은 수를 분리하기 위해 사용되는 것들로부터 개발되었다. 그러나, 치료를 개선하기 위해일 및 전기 생리 분석 또는 생화학 적 연구에 대한 심층적 인 이상 심장 멜라닌 세포의 생존, 우리는 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된에서 정제 과정을 개발했다. 이 리뷰에서 설명하고 입증 절차는 순수한 인구 또는 심근으로 도금 될 수 건강한 심장 멜라닌을 생산하는 장점이있다.

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프로토콜

1 필요한 솔루션 및 장비 준비

  1. 첫째, 15 분간 고압 증기 멸균을하여 수술기구 (직선 모양 집게, 곡선 모양 집게, 직선 모양 가위, 곡선 모양의 가위) 소독. 121 ° C에서. 조직을 닦지에 사용되는 하나의 세트가 마음과 다른 세트를 해부에 사용되는 악기, 2 세트를 준비합니다.
  2. 살균, 여과 물 900 ㎖에 MCDB153 문화 미디어의 한 패킷을 녹이고 분말이 용해 될 때까지 천천히 저어. 1.2 g의 중탄산 나트륨, 또는 15.7 ml의 나트륨 바이 카보네이트 용액, 배지의 최종 부피의 각각의 리터를 준비하고 용해 될 때까지 교반중인 [V / w 7.5 %]를 추가한다. 다음 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 무균 조건 하에서 0.2 μm의 병 상단 필터를 통해 미디어를 부어, 1 N 염산 또는 1 N의 NaOH를 추가하여 7.2으로 산도를 조정합니다. 그런 다음 미디어를 수집하고 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 보충제를 준비배양 배지 (자료 목록)에 추가합니다. 보충 미디어 세포 도금에 필요한 미디어 직전에 첨가한다.
  4. 10 % FBS 플러스 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)와 DPBS를 준비합니다.
  5. DPBS 플러스 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신) 100 ㎖에, 다음에, 0.25 g의 트립신 (USB 소의 췌장 활동> 2500 USP 단위 / ㎎, 초순수)을 첨가하여 0.25 % 트립신 용액을 제조 하였다.
  6. 이 절차를 완료하는 데 필요한 기타 필요한 장비는 입체 현미경, 페트리 접시 (10 cm), 50 ML 원뿔 튜브, 40 μm의 셀 스트레이너, DPBS 플러스 항생제, 60-mm 배양 접시 35-mm 배양 접시를 포함한다.

2 신생아 마우스 새끼들까지 잔치에서 하트의 분리

  1. 먼저, P2 신생아 마우스 새끼에 P0을 얻었다 (N = 6-8). EYFP 대립 유전자 또는 라벨을 붙이기 위해 Z / EG 대립 유전자 : 그것은 R26R 중 이형 아르 남성과 DCT-Cre 호텔에게 동형 접합 여성의 번식에 의해 생성 된 새끼를 사용하는 것이 좋습니다멜라닌 세포 유사 세포. 두 R26R는 : EYFP 및 Z / EG 마우스는 잭슨 연구소 (주식 수는 각각 006,148과 003,920)에서 사용할 수 있습니다.
  2. 다음으로, 신생아 마우스 새끼를 안락사 알코올 면봉으로 자신의 가슴을 닦아 낸 후 DPBS와 10 cm 페트리 접시에 새끼를 놓습니다.
  3. 가슴을 통해 피부를 잘라 소독 집게와 가위로 흉골 후 실체 현미경을 이용하여 조심스럽게 가슴을 엽니 다. 신생아 마우스 새끼의 마음이 부착 된 심방과 심장 전체를 제거해야합니다주의해야하므로 매우 작은 수 있습니다.
  4. DPBS에 마음을 씻고 새로운 10 cm 페트리 접시로 전송.

3 효소 소화

  1. 조직 문화 후드 (생물 안전 캐비닛)에 절제 마음 페트리 접시를 가져와 다음 후드에서 멸균 기술을 이용하여 아래의 단계를 따릅니다.
  2. 첫째, 무균 DPBS 플러스 항생제의 마음을 세 번 씻는다.
  3. 에서 (N = 6-8) 마음을 놓으십시오60 mm 배양 접시와 접시에 0.5 % 트립신 용액 6-8 ML을 추가합니다.
  4. 다음으로, (크기가 1 mm 이하) 작은 조각으로 마음을 절감하고 5 % CO 2 분위기에서 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품어.
  5. 잠복기가 완료된 후, 50 ㎖의 멸균 원추형 튜브에 심장 조직과 접시에서 트립신의 생성 된 용액을 붓는다.
  6. 그런 다음, 신속하게 조심스럽게 10 ml의 멸균 피펫을 사용하여 50-ML 원뿔 튜브 30 ~ 50 시간에서 솔루션을 씹다.
  7. 여액을 수집하고 새로운 깨끗한 50ml의 원뿔형 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 얻어진 용액을 필터.
  8. 이어서, 실온에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 240 × g에서 50 mL의 원심 분리 튜브. 그런 다음 조심스럽게 뜨는을 대기음 및 멸균 DPBS의 6-8 ㎖에 남아있는 펠렛을 재현 탁. 이 단계 2 번 더 반복합니다. 이 단계는 심방 근육 세포와 심장 멜라닌 세포를 펠렛하지만 소설을 미치지 않습니다섬유 아세포 이후 broblasts는 작은 상등액에 남아있게됩니다.

4 도금 심장 멜라닌 세포 유사 세포

  1. 신중하게 배출 또는 세척 용액 (DPBS)를 대기음 및 MCDB 문화 미디어 6 ML에서 펠렛을 재현 탁, 원심 분리 후 세번째 린스를 따라하는 것은 어떤 보충제가 추가되었습니다합니다.
  2. 이제, 멸균 전송 피펫으로 재 부유 솔루션을 그리고 35 mm 접시에 세포를 올려 놓거나, 6 웰 플레이트의 잘, 그리고 한 35-mm 접시에 세 신생아 쥐에서 분리 된 심장 세포를 풀거나 잘.
  3. , 5 % CO 2 분위기에서 하룻밤 37 ° C에서 요리를 품어 모든 부착되지 않은 세포와 함께 배양 배지를 흡인 한 후 DPBS 한 번 번호판을 씻어. 그런 다음 접시에 신선한 미디어를 추가하고 미디어마다 이일을 교체합니다. 세포는 성인 듣고에서 격리 반면 신생아 또는 배아 마음에서 고립 된 세포는 최대 3 주 동안 배양 유지 될 수있다TS는 최대 10 일 동안 배양 유지할 수있다.

성인 마우스의 심장에서 5 고립시키기 심장 멜라닌 세포와 같은 세포

  1. 첫째, 성숙 마우스의 마음 제거 (3-4 주령을, N = 3) 마우스에 헤파린 100 U의 복강 내 투여 한 다음를 안락사 후 중간 줄 흉골 절개를 통해. 그것은이 절차 쥐를 안락사하는 펜토 바르 비탈을 사용하는 것이 좋습니다,하지만이 약은 모든 지역에서 사용할 수 없습니다.
  2. 다음으로, 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 항생제를 포함하는 멸균 DPBS에 절제의 마음을 씻는다. 그들에 남아있는 혈액을 제거하고 DPBS에 한 번 더 마음을 씻어 곡선 해부 포셉 약간 마음을 짠다.
  3. 마음에서 심방과 방실 고리를 제거합니다 (이러한 구조는 멜라닌 세포 유사 세포를 포함) 및 35 mm 접시에 절제 조직 표본을 배치합니다.
  4. 곡선 가위와 힘을 사용하여 작은 조각으로 마음을 잘라추신 후 접시에 0.5 % 트립신 용액을 6-8 ML을 추가합니다. 그런 다음 45 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어.
  5. 이제, 이후 단계 3.6에서 시작하여 위의 프로 시저의 단계를 따릅니다.

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결과

이 문서에서 설명하는 프로토콜은 우리가 이전에 쥐의 심장에서 심장 멜라닌 세포를 분리 출판 일에 비해 개선 된 기술이다. 이 절차는 심장 멜라닌 세포 유사 세포를 라벨 멜라닌 합성 효소 특이 치운다 재조합 효소에 의해 구동되는 형광 마커의 사용을 채택한다. 이 심방 근육 세포에서 심장 멜라닌 세포를 구별 형태 학적 차이는 아직 (그림 1A)을 개발하지 않았기 때문에, 갓 격리 된 배아 또는 신생아 세포 작업을 할 때 심장 멜라닌 세포에 라벨 마커를 사용하는 것이 중요합니다. 분리 단계는 잘 간 경우도 1a에 나타낸 바와 같이, 심방 심장 근세포 및 멜라노 사이트의 상당히 많은 수의 단지 몇 개의 비 - 부착 세포와 라미닌 코팅 접시에 부착된다. 이 경우, 부착 세포는 접시 (황색 화살촉도 1a, 화살촉)의 바닥에 평평하게 나타날 것이다. 한편, 경우 proce을틀리면 잘 작동하지 않는 세포의 대부분은 비 부착되며 종종 구형보고 (하늘색 ...

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토론

심장 멜라닌 세포는 일반적으로 심방 부정맥 트리거를 야기 심장 내에서 해부학 적 위치에 있습니다. 이 지역은 폐 혈관, 방실 고리, 후방 좌심방과 난원 공 개존증 (그림 4)를 포함한다. 이러한 세포가 arrhythmogenesis에서의 역할을 이해하기 위해, 우리는 그들을 격리하고 그들의 생리학을 연구하는 기술을 개발한다. 그러나, 우리는이 기술을 개선하는 것은 심장 멜라닌 세포의 건강하고 더 많은 양의 외생 적 자극에 대한 심장 멜라닌 세포의 반응을 조사하기 위해 추가 연구를 허용 할 얻을 것을 인정했다. 또한, 개선 된 분리 기술은 정상적인 생리 질환 중 심방 심장 근육 세포와 멜라노 사이트의 상호 작용을 조사하는 연구를 허용 할 수있다.

이 논문은 우리가 ISOL하기위한 프로토콜에서 개발 된 마우스 마음에서 가능한 멜라닌 세포 유사 세포를 분리하는 절차를 설명합니다피부에서 멜라닌 세포를 먹었다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 마음에서 멜라닌...

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공개 사항

우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

이 작품은 VVPMDL에 건강 상 R01 HL105734의 국립 연구소에 의해 지원되었다 건강 연구 경력 상 K08 HL094748의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다. VVP 교부 11IRG900384 지원하는 미국 심장 협회 (American Heart Association)의 혁신 연구원이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MCDB 153Sigma-AldrichM7403물에 용해
DPBS, 칼슘 및 마그네슘 미포함Invitrogen14190136스톡 농도: 1x
작동 농도: 1x
Penicillin-streptomycinInvitrogen15140163스톡 농도: 100x
작동 농도: 1x
Fetal Bovine SerumLife TechnologyCertified작동 농도: 4%
TPASigma-AldrichP1585DMSO에 용해
스톡 농도: 3.2 μM
작동 농도: 32 nM
TransferrinSigma-AldrichT8158DPBS에 용해
스톡 농도: 0.1 mg/ml
작동 농도: 1 μg/ml
Dibutyryl cyclic AMPSigma-AldrichD0627DPBS에 용해
스톡 농도: 0.5 mM
작동 농도: 5 μM
InsulinSigma-AldrichI663410 mM 아세트산에 용해
스톡 농도: 1 mg/ml
작동 농도: 5 μg/ml
Basic FGFBD Biosciences354060물에 용해
스톡 농도: 4 ng/μl
작동 농도: 4 ng/ml

참고문헌

  1. Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
  2. Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
  3. Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
  4. Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
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  6. Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
  7. Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
  8. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
  9. Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
  10. Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).

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