Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 판의 앞쪽 영역이 척추 망막에 상승을 제공하는 과정은 임상과 기초 모두 연구의 주요 초점이되고 있습니다. 망막 질환을 이해하고 치료에 대한 명백한 의료 관련뿐만 아니라, 척추 망막의 개발을 이해 neuronal 세포 유형 결정과 차별화 1-16에 대한 중요하고 우아한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 신경 망막은 틀에 박힌 층에 배치 여섯 개별 세포 유형 (신경절, 수평, amacrine photoreceptors, 양극성 세포와 뮐러 glial 세포), 대체로 모든 vertebrates 12,14-18 사이에 보존되어있는 패턴으로 구성됩니다.
그대로 개발 배아에서 망막을 공부하는 것은 분명이 복잡한 기관은 계층 구조로 forebrain의 돌출부에서 어떻게 전개되는지 이해가 필요합니다 동안 이리저리 혜택을 많은 질문이 있습니다m 추정 망막 세포의 주요 세포 배양 7,19-23을 사용하여 방식을 채용. 예를 들어, 서로 다른 단계에서 제거 dissociated 조직의 세포를 분석하는 것은 하나는 다른 발달 단계에서 개별 셀의 사양의 상태를 분별 할 수있다 즉, 주변 조직 8,19-22와의 상호 작용의 부재에있는 세포의 운명 ,24-33. 기본 세포 배양은 또한 탐정 특정 시약과 문화를 처리하고 단일 세포 수준 5,8,21,24,27-30,33-39에 결과를 분석 할 수 있습니다. Xenopus laevis의 연구 고전 모델 시스템은 초기 신경 발달 19,27,29,31-32,40-42은 망막 기본 세포 배양 10,38,43-45에 특히 적합한 시스템으로 제공하고 있습니다.
추정 망막 조직은 즉시 신경 유도 25,38,43 따라 개발 초기 단계에서 액세스 할 수 있습니다. 또한, 일을 부여태아의 각 셀 노른자의 공급을 포함에서 망막 세포가 버퍼 소금 솔루션으로 구성된 매우 간단한 정의 미디어에서 배양 할 수 있습니다, 따라서 부화 또는 기타 커 기반 제품 10,24,44-45의 혼란 효과를 제거 .
그러나, 주변 조직 및 후속 처리에서 망막 조직의 격리 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 결과적으로, 단일 세포의 해상도 칼슘 활동 및 유전자 표현 분석됩니다 기본 셀 문화를 준비하는 데 사용됩니다 Xenopus laevis의 망막 세포의 분해 및 분리하기위한 방법을 제시한다. 본 논문에서 제시 한 주제 자발적인 칼슘 과도의 분석이지만, 기술은 연구 질문 및 접근 방법 (그림 1)의 다양한 배열 광범위하게 적용됩니다.
프로토콜
모든 실험은 윌리엄과 메리의 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행됩니다. 이 프로토콜에서 참조 발달 단계 Nieuwkoop와 페이버 46에 따라 수 있습니다.
1. 해부
- 세포 배양 매체와 실내 온도로 평형하는 칼슘 마그네슘 무료 매체 (CMF)를 허용합니다. 당신은 또한 0.1X 마크의 수정 된 벨소리의 (MMR) 산도를 7.4-7.6이 필요합니다.
- 세포 배양 층류 후드에서 30 분 동안 UV 빛을 적용하여 다음 항목을 살균. (후드에 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 각 항목을 스프레이.)
- 35mm 플라스틱 배양 접시.
- 60mm 플라스틱 배양 접시.
- 35mm Nunclon 표면 요리.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브.
- P1000 micropipette (1,000 μl의 micropipette).
- 에어로졸 방지 P1000 팁 (1,000 μl micropipette의 에어로졸 방지 도움말 참조).
- 알코올방지 펜.
- 포셉을 해부하고 좋아요.
- * 15 ML 원뿔 튜브 (단 이미징 칼슘 ....
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결과
성공적으로 해부하는 광 소포 (단계 25)와 retinae (무대 35)의 예는 2E와 2J 그림에 표시됩니다. 이 프로토콜이 개발의 여러 단계에서 사용할 수 있지만, 더 실험에 대한 정확성을 보장하기 위해 만 망막 조직을 얻는 것이 중요합니다. 조심스럽게 모든 단계에서 표피를 제거하고 포셉의 망막 조직을 주사하지 않도록. 단계 35 세 이상에서, 렌즈는 망막 위에 맑은 층으로 간주 할 수 있으며, 포셉을 사용하여주의 해주세요하여 제거 할 수 있습니다.
성공적으로 도금 기본 세포 배양은도 3a에 표시됩니다. 조직을 dissociating 때, 세정 솔루션에 dissociating에서 조직을 방지하기 위해 권장되는 30 초 배양 시간보다 더 오래 씻어 솔루션에 망막 explant을 떠나지 않는 것이 중요합니다. 또한, 조직 전체 시간 동안 트립신 용액에 해리 할 수 있는지 확인문화 판에서 세포의도 배포 할 수 있도.......
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토론
모든 vertebrates에서 보존 아르는 잘 특징 세포 유형으로, 망막은 셀 타입 사양과 차별화에 관한 분자 - 세포 프로세스를 공부에 유용한 모델을 제공합니다. 기본 세포 배양은 유전자 발현, 단백질 역학, 그리고 칼슘 및 단일 셀 해상도 수준의 전기 활동을 포함한 과정의 광범위한 조사를위한 강력한 방법을 갖게. 여기에 우리가 추정 망막 개발하고 기본 세포 배양의 매우 초기 단계에서 쉽게 액세스 할 수 있는지 Xenopus laevis, 주어진 이러한 연구 특히 의무가 유기체의 해부 추정 망막 조직의 기본 세포 배양을위한 간단한 기술을 제시가에 발생할 수 있습니다 간단한 생리 식염수로 구성된 정의 미디어.
대부분의 실험실 설정에 쉽게 적응하지만, 특히 세심한주의가 필요합니다 몇 가지 단계가 있습니다. Dissecti기능은 신선한 날카롭게 포셉을 수행해야합니다. 세포 배양 매체와 혼합 Collagenase B 치료의 젊은 단계 (
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 기꺼이 스크립트에 박사 존 헤이즈 감사, Drs. 에릭 브레 디하고 공 촛점 현미경과 지원 크리스토퍼 델 흑인, 드류 휴즈, 프로젝트를 개발하고 예비 데이터를 제공에서 그의 작품을위한 로라 Odorizzi, 알렉스 Garafalo, 레베카 Lowden, 그리고 리즈 MacMurray, 통계 분석에 대한 유용한 제안 박사 그렉 스미스. 이 작품은 MSS에 대한 NIH 보조금 (NINDS IR15N5067566-01)와 윌리엄과 메리의 대학에 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 교부금에 의해 지원되었다.
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재료
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| 일회용 폴리스티렌 페트리 요리, 60 X 15mm | 어부 | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
| 35mm Nunclon 표면 배양 접시 (Airvent 포함) | 어부 | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
| 뒤몽 좋은 집게 (Dumostar # 55) | 어부 | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
| Cellattice 마이크로 지배 플라스틱 coverslip, 25mm | 어부 | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
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표 2. 특정 시약 및 장비. | ||||||||||||||||||||||||
페니실린과 스트렙토 마이신은 우리의 문화 미디어에 사용되는 동안 솔루션. * Gentamicin, 항생제는 우리 MMR 솔루션에서 사용됩니다. |
참고문헌
- Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
- Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The....
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