방법 논문

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

DOI:

10.3791/4381

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2013년 2월 24일

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1Department of Biology, University of Washington

이 논문에서

요약

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후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.

초록

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모든 생물은 환경에 자신의 행동 및 생리적 반응을 결정하는 감각 자극으로 가득 찬 세상을 살고 있습니다. 후각은에 응답하고, 사이, 복잡한 냄새 자극을 차별하기 위해 후각 시스템을 사용 곤충에 특히 중요합니다. 이 냄새는 재생산 및 서식지 선택 1-3로 프로세스를 중재하는 행동을 이끌어내는. 또한, 수분 4-6 식품 작물 7 herbivory, 질병 8,9의 전송을 포함하여 농업과 인간의 건강을 위해 매우 중요 곤충의 mediates 동작에 의한 화학 감지. 후각 신호와 곤충 행동에서의 역할 확인은 생태 학적 프로세스와 인간의 음식 자원과 웰빙을 모두 이해하는 따라서 중요합니다.

현재까지, 곤충의 행동을 유도 휘발성 물질의 식별이 어렵고 종종 지루한했다. 현재 기술은 다음과 같습니다가스 크로마토 그래피 결합 electroantennogram 기록 (GC-EAG) 및 가스 단일 sensillum 레코딩 (GC-SSR) 10-12를 크로마토 그래피 - 커플 링. 이 기술은 bioactive 화합물의 식별에 중요한 것으로 판명. 13,14, 우리는 antennal 엽에있는 뉴런 (곤충의 기본 후각 센터 AL)에서 멀티 채널 electrophysiological 레코딩 ( 'GCMR'이라고한다)에 커플 링 된 가스 크로마토 그래피를 사용하는 방법을 개발했습니다. 이 최신 기술은 우리가 냄새 정보가 곤충 뇌에 표시하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 후각 처리의 수준 냄새에 신경 응답이 AL의 뉴런에 안테나의 수용체 뉴런의 수렴의 정도에 매우 민감 인하여 때문에 또한, AL 녹음은 자연 냄새 효율적이고 고감도로의 활성 성분의 검출을 할 수 있습니다. 여기 GCMR을 설명하고 사용 예를 제공합니다.

몇몇 일반적인 단계는 invol 아르bioactive 휘발성 물질과 곤충 응답의 검출에 ved. 휘발성 물질 먼저 관심 소스에서 수집 (이 예에서 우리는 속 Mimulus (Phyrmaceae)에서 꽃을 사용) 및 표준 GC-MS 기술에게 14-16를 사용하여 필요에 따라 특징해야합니다. 곤충은 기록 전극이 신경 녹음이 시작 antennal 엽 및 다중 채널에 삽입 된 후, 최소한의 절개를 사용하여 학습을위한 준비가되어 있습니다. 신경 데이터의 후 처리는 특정 odorants는 곤충 신경계에서 중요한 신경 반응의 원인이되는 드러내고있다.

우리가 여기에 제시 예는 수분 연구에 특정한이지만, GCMR는 연구 생물 및 휘발성 소스의 광범위한 확장 할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법은 odorants 벡터 곤충, 농작물 해충을 끌거나 repelling의 식별에 사용할 수 있습니다. 또한, GCMR는 또한 PO 등의 유익 곤충에 대한 attractants를 식별하는 데 사용할 수 있습니다llinators. 기술은뿐만 아니라 비 곤충 분야로 확대 할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 휘발성 Follection

  1. 이 예제에서, 우리는 M.에서 휘발성 샘플을 사용하여 lewisii 꽃 - 캘리포니아에 고산 야생화의 기본. 휘발성 물질이 Riffell 외에 따라 동적 흡착 방법을 사용하여 수집하고 있습니다. 14. 간단히,이 방법은 꽃이 테플론 백에 동봉되는 폐 루프 트래핑 시스템을 사용합니다. 불활성 진공 펌프 사용하여 꽃 주변의 공기는 Porapak Q 행렬로 가득 파스퇴르 피펫으로 구성 "덫"을 통해 형편입니다. 펌프의 반환 공기는 활성탄에 의해 필터링됩니다. 소정의 기간 후에, 우리의 경우 24 H에, Porapak Q 행렬은 집중 추출물를 수집하기 위해, 비 극지 용매, 일반적으로 헥산으로 용출되어 있습니다. 추출물 그런 다음 -80 ° C에서 분석 될 때까지 저장됩니다. 필요한 경우, 샘플은 질소 가스의 흐름에 따라 사전 분석에 집중 할 수 있습니다. 샘플은 이미 잘 - 특징 않는 한,를 통해 그것을 나누어지는을 실행기체 크로마토 그래프 - 질량 분석기 (GC-MS)는 샘플을 사용하기 전에 휘발성 구성 요소를 식별합니다.

2. Electrophysiological 준비

  1. 1000....

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결과

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M.를 사용하여 GCMR 분석에서 lewisii 꽃 향기가, 우리는 GC에 추출물의 3 μl를 삽입. GC를 통해 용출 휘발성 물질의 총 수는 일반적으로 60-70 휘발성 물질입니다. M.의 향기 lewisii는 주로 여섯 탄소 등 2 헥산 올과 같은 휘발성 물질, 그리고 천정 공간의 <1 %를 구성하는 sesquiterpenoids로 구성된 향기의 나머지 부분과 함께, β-myrcene (acyclic)와 α-피넨 포함 monoterpenoids로 구성되어 있습니다.

GCMR는 antennal 엽의 뉴런의 감도뿐만 아니라 생물학적으로 중요한 휘발성 물질의 neuronal 처리를 활용합니다. 그러나,이 자연의 멀티 채널 녹음이 효과에 antennal 엽에있는 뉴런의 무작위 표본을 채취하시면됩니다. 다른 준비 사이의 프로브 위치의 위치에 약간의 변화가 기록 배열이 다른 뉴런를 .......

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토론

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곤충 후각로 인한 행동이 복제, 호스트 사이트 선택, 적절한 음식 자원의 식별 등을 포함하여 다양한 프로세스를 운전합니다. 이러한 프로세스의 연구는 소스뿐만 아니라 행동을 중재 아르 이러한 화합물을 식별 할 수있는 능력에서 방출 된 휘발성 물질을 식별 할 수있는 능력이 필요합니다. 문제를 복잡하게하는 것은 냄새가 함께 각각의 성분 6,7,13,19,20 다르게 인식되고 독특한 향을 만들어 각각의 화합물의 수백 수십 구성된다는 것입니다. 처음 성 페로몬 시스템 12 실시 연구, 그리고 더 최근의 식품 및 산란 관련 냄새 13,20에서, 혼합물의 행동 효과는 혼합에 몇, 주요 휘발성 물질의 함수로 거주하는 것으로 나타하고 있습니다 혼합물은 개별 성분보다 훨씬 더 큰 행동 반응을 이끌어내는 것을. 그 키를 식별성분 따라서 현대 화학 생태뿐만 아니라 후각 신경 생물학의 중요한 구성 요소입니다.

기술의 다양한 곤충의 행동을 유.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 NSF 기금 IOS 1,121,692에 의해, 워싱턴의 연구 재단의 대학에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항목의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
Porapak 타입 Q 80-100 메쉬 워터스 WAT027060
레이놀즈 오븐 가방 레이놀즈
GC 애질런트 7820A
GC 컬럼 J & W 과학, Folsom, CA, USA DB-5 (30m, 0.25 mm, 0.25 μm)
분석 헬륨 캐리어 가스 Praxair HE K 한 참조 / 분
16 채널 실리콘 전극 Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
정밀 와이어 NiCr, 0.012 mm 직경) Sandvik Kanthal HP 리드 PX000004 사용자 정의 tetrodes 및 stereotrodes을 만들기위한
사전 증폭기 터커 - 데이비스 시스템 PZ-2
증폭기 터커 - 데이비스 시스템 RZ-2
데이터 수집 시스템 - OpenEx 스위트 터커 - 데이비스 시스템
온라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - SpikePac 터커 - 데이비스 시스템
오프라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - Mclust 스파이크 - 정렬 도구 상자 데이비드 Redish, 신경 과학, 대학학과미네소타 에서 무료로 다운로드 http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB 도구 상자

참고문헌

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  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G.

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재인쇄 및 허가

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태그

Olfactory VolatilesGas ChromatographyMulti unit RecordingsInsect Antennal LobeBumblebee BrainNeural RecordingsFloral HeadspaceElectrodes InsertionGCMR TechniqueVolatile Detection

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