에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수 생체 내 실험 시스템.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
생체 실험 모델과 적응 면역을 공부 연구자에 대한 기본적인 필요는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 특이성에 따라 T 세포를 식별 할 수 있다는 것입니다. 많은 간접 방법은 T 세포의 대량 인구가 특정 항원과 에피토프 특정 T 세포 등 확산, 시토 킨 생산, 또는 활성 마커 하나의 표현과 같은 기능 응답의 측정을 통해 확인할 수 있습니다와 체외에서 자극되는 이용하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 여러 가지 기능 중 하나를 전시 에피토프 특정 T 세포를 식별, 그들은 순진한 전구체 주파수에서 에피토프 특정 T 세포를 감지 할 수있을만큼 문자를 구분하지 않습니다. 인기있는 대안은, TCR 유전자 변형 입양 이전 모델 인에서 TCR 유전자 변형 마우스의 단클론 T 세포는 easi 수 있습니다 에피토프 특정 T 세포의 큰 전구체 인구를 만들 histocompatible 호스트에 놓는 아르통증은 congenic 마커 항체 2,3의 사용을 추적. 강력한 있지만,이 방법은 4,5 하나의 에피토프에 대한 특이성과 T 세포의 unphysiological 주파수와 관련된 실험 유물을 앓고. 또한,이 시스템은 polyclonal 인구에서 에피토프 특정 T 세포 클론의 기능 이질성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다.
MHC (pMHC) 단지 : 적응 면역을 연구 할 수있는 이상적인 방법은 전적으로 해당 펩타이드 기원에 바인딩하여 TCR의 특이성을 구별하는 방법을 사용하여 내생 T 세포 레퍼토리의 에피토프 특정 T 세포의 직접 검출을 포함해야합니다. pMHC tetramers 및 유동 세포 계측법의 사용이 6 달성 있지만 다음과 같은 항원 유발 clonal 확장을 발견 에피토프 특정 T 세포의 높은 주파수 인구의 감지로 제한됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 pMHC의 tetramers의 사용을 조정 방법 및 magne을 설명틱 세포 농축 기술은 마우스 림프 조직 3,7에서 매우 낮은 주파수 에피토프 특정 T 세포의 탐색 기능을 사용하도록 설정합니다. 이 기술로, 하나는 종합적으로 면역 반응의 모든 단계에서 쥐 내생 T 세포의 전체 에피토프 별 인구를 추적 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 림프 조직에서 세포 절연
- 의 작은 사각형이 포함 된 60mm 문화 요리에, 얼음 차가운 cEHAA (EHAA + 10% FBS, 펜 / 패 혈성, gentamycin, 2 MM L-글루타민, 55 MM 2 메르 캅토 에탄올) 또는 기타 이에 상응하는 T 세포 매체 1 ML을 추가 얼음에 100 μm 나일론 메쉬 및 장소.
- 마우스를 안락사시켜야.
- 비장 가능한 많은 쉽게 접근 할 수 림프절을 제거합니다. 이러한 적어도 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부, 그리고 장간막 림프절을 포함해야합니다. 배양 접시에있는 나일론 메쉬의 상단에 올려 놓으십시오.
- 부드럽게 덧는 림프구를 해방하기 위해 나일론 메쉬 동안 폐쇄 1.5 ML의 microfuge 튜브의 평면 상단을 림프 조직 사용합니다. 정지에 셀을 작업 할 cEHAA와 pipet 위아래로 다른 한 ML을 추가합니다. 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 맨 위에 위치 나일론 메쉬의 또 다른 작품을 통해 셀을 전송합니다. 얼음 차가운 cEHAA, PO의 또 다른 한 ML 함께 그릇과 메쉬를 씻어같은 관에 볼륨을 oling. 4 ML의 최종 세포 현탁액 볼륨을 달성하기 위해 반복합니다.
- 15 ML의 최종 볼륨 (P....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 2는 이전에 관련 펩타이드 + CFA와 함께 예방 접종을 쥐 대표 데이터를 묘사하면서 그림 1은 순진 쥐에서 pMHCII tetramer 강화 비장과 림프절 샘플을 대표하는 유동 세포 계측법의 음모를 도시한다. 시리얼 게이트는 CD4의 분석 + T 세포 인구에서 autofluorescent 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거합니다. CD8 + T 세포 인구는 CD4의 pMHCII tetramer의 착색 + T 세포에 유용한 내부 대조군 역할을합니다. 강화에서 바인딩 된 분수는 일반적으로 게이팅 더 도전하고, 언 바운드 분수보다 autofluorescent 세포의 상당히 높은 비율을 포함합니다.
샘플의 에피토프 특정 T 세포의 절대 수는 determi으로 tetramer의 + 아르 이러한 세포의 비율과 함께 구슬 개수 분석에서 결정, 농축 샘플의 바인딩 분율에있는 모든 세포의 총 수를 곱하여 계산세포 염색 분석 (.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서 제공 pMHC tetramer 기반의 세포 농축 방법은 내생 T 세포 repertoires에서 에피토프 특정 T 세포를 연구하기위한 강력한 도구입니다. pMHC의 tetramers의 사용은 직접적으로 기원 pMHC 리간드를 구속하기 위해 자신의 TCRs의 능력에 따라 에피토프 특정 T 세포의 확인을 할 수 있습니다. 강화는 항원에 특정한 T 세포의 매우 희귀 한 인구는 자신의 유전 메이크업이나 전구체 주파수의 조작없이 T 세포의 내생 repertoires에서 감지 할 수 있도록 감도 수준을 제공합니다. 결과적으로,이 기술은 탐정 직접 면역 반응의 모든 단계를 통해 순진한 수준에서 생체 실험 시스템에서의 내생 항원에 특정한 T 세포 인구를 추적 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 에피토프 특정 CD4 + 보조 림프 기관에서 T 세포를 풍부하게 pMHC 클래스 II (pMHCII) tetramers의 사용에 최적화되었습니다마우스 s입니.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는이 프로토콜의 개발에 도움을 젠킨스 연구소의 앙드레 한과 로렌스의 엔 기술 지원 및 회원 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 공급 업체 카탈로그 번호 | |||
| PE 또는 APC 복합 pMHC tetramer (또는 multimer) | NIH tetramer 코어에서 얻은, 조사원에 의해 제작, 또는 상업적 소스에서 구입 | ||
| 안티 - PE 복합 자성 microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| 안티 - APC 복합 자성 microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS 자기 열 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석 | Miltenyi | 130-042-302 또는 130-090-976 | |
| 셀 계산 비즈 | 생명 기술 | PCB-100 |
참고문헌
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
