E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

Summary

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

Abstract

포유류의 세포에서 유전자 발현의 기능 불 활성화는 다양한 경로의 ^1,2의 관심 단백질의 기여에 관한 연구하는데 매우 중요합니다. 제정 최저 시간이 ^3-5 오랜 기간 동안 세포 용납되지 않은 경우 그러나, 유전자 표현의 조건 최저는 경우에 필요합니다. 여기 ACF 염색질 리모델링 요소의 subunits의 조건 최저를 허용 세포 라인의 준비를위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 세포 라인은 아데노 바이러스 E4orf4 단백질 ⁶ 셀 죽음의 유도에 ACF의 노력의 결정을 용이하게합니다. ACF 염색질 리모델링 인자의 Acf1 및 SNF2h subunits에 대한 짧은 머리 핀의 자형 RNAs를 인코딩 순서는 또한 neomycin 내성 유전자에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드의 doxycycline-inducible업자 옆에 복제되었습니다. Neomycin 방지 세포 클론은 G418과 절연의 존재에 선정되었다. 그 결과 세포 라인에 의해 유도 된doxycycline 치료는 한 번 Acf1 또는 SNF2h 표현 수준이 감소되었다 세포는 플라스미드 인코딩 E4orf4하거나 빈 벡터와 transfected했다. shRNA 구조의 특정 효과를 확인하려면 Acf1 또는 SNF2h 단백질 수준은 침묵 변이의 도입에 의해 shRNA에 저항력이 렌더링 된 플라스미드 표현 Acf1 또는 SNF2h과 cotransfection에 의해 WT 수준으로 복원되었습니다. 다양한 샘플에서 세포 죽음을 유도하는 E4orf4의 능력은 transfected 세포 인구의 apoptotic morphologies과 핵의 모양의 빈도가 ^7-9 측정 된에 DAPI 분석에 의해 산출 된 것입니다.

제정 최저 셀은 치명적 될 때 여기에 설명 된 프로토콜은 경우에 자신의 단백질 파트너가 세포 죽음을 유도하는 여러 단백질의 기능 공헌 결정에 활용 될 수있다.

Protocol

1. Inducible 셀 라인의 생성

1. 하나는 원하는 세포 라인의 준비에 사용 된 모든 세포를 죽이는 약물 G418의 최소 농도를 찾을 필요가 실험하기 전에. 이러한 목적을 위해, 실험 기간 동안 사용하고 G418의 증가 농도 (ML 당 0-1,000 μg)을 추가합니다 매체에 confluency 70%에 여러 개의 중복 된 플레이트에 플레이트 선택한 셀을. 효율적으로 세포를 죽이는 최소한의 G418 농도를 결정하는 매일 셀을 모니터링 할 수 있습니다. 세포 죽음이 3-7일에서 관찰된다.
2. 이 shRNA을 표현 플라스미드는 연구에 따라 유전자의 어느 정도 표현으로 줄일 수있는 과도 transfection의 assays에 의해 확인하는 것이 좋습니다 세포 라인의 생성하기 전에. 이것은 효율적으로 transfected 수있는 모든 세포주에서 수행 할 수 있습니다.
3. DMEM 매체 (10 % Tet 싸이를 포함하는 8 ML의 10cm 접시 당 ⁶ 5x10 주변 세포의 밀도 플레이트 T-렉스-293은 세포줄기 승인 FBS, 2mM L-글루타민, ML 페니실린 100 단위 및 ML 스트렙토 마이신 당 0.1 밀리그램, ML blasticidin 당 5 μg). 37 박 번호판을 길러 ° C, 5 % CO _2.....

Discussion

특정 유전자 표현의 최저는 규제 경로로 단백질의 기여의 조사에 중요한 접근 방식이다. 필수 유전자의 표현의 제정 최저 부정적인 세포 증식에​​ 영향을 미치는 때문에, 그들의 연구는 과도 siRNAs의 도입이나 안정적인 조건 최저 시스템의 응용 프로그램 중 하나를 필요로 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 shRNAs의 약물 유발 표현을 수용 할 수있는 안정적인 세포 라인의 생성, 많은 세포 라인에 효율적으로되지 않을 수 있습니다 과도 transfections 이상의 이점을 제공하며, 반복 준비를 필요로 바이러스의 사용에 때때로 추가 단기 용어 선택합니다. 한 번 생성 된 세포 라인, 추가 준비가 필요하지 않습니다. 또한, 우리 손에, shRNA 구조의 과도 transfections은 선택된 셀 라인에 shRNA 식의 유도에 비해 훨씬 효율적인 유전자 발현를 쓰러 뜨린에 있었다. 이 추천입니다에드 그러나 약물 유발 최저 효율적 남아 각 실험에서 확인할 수 있습니다. 유전자 표현의 조건 최저위한 안정적인 세포 라인의 사용 가능성 단.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
높은 포도당 DMEM	Gibco	41,965
Tet 시스템 승인 FBS	Clontech	631106
L-글루타민	Gibco	25,030
펜 패 혈성	Gibco	15,140
0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	Gibco	25,200
T-렉스-293 세포	Invitrogen	R710-07
G418	시그마	A1720
blasticidin	Invit로겐	R210-01
플라스미드 pSuperior.neo + GFP	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfection	101-40
doxycycline	시그마	D9891
paraformaldehyde	전자 현미경 과학	15,710
4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)	시그마	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01