여기에 장기 후각 적응의 분자 기록을 설명 Caenorhabditis elegans. 단백질은 키나제 G, EGL-4는, AWC라는 기본 감각 뉴런 쌍의 안정적인 적응 응답이 필요합니다. 세포 기질의 AWC의 핵에 장시간 냄새에 노출 EGL-4 translocates 동안.
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이 논문에서
요약
초록
지속적인 자극하는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호의 감도를 감소하여 반응을 적응합니다. 적응 반응은 모양의주의를 할 수 있으며, 오버 자극 세포를 보호합니다. C.의 후각 회로에 적응 elegans 먼저 콜버트와 Bargmann 1,2에 의해 설명되었다. 여기에서 저자들은 Amphid 윙 셀 타입 C (AWC) 감각 뉴런에 의해 감지 휘발성 냄새에 적응하는 능력에 돌연변이가 결함 분리하는 유전자 화면을 설계하는 데 사용되는 후각 적응 패러다임의 매개 변수를 정의. 때 wildtype C. elegans 동물들은 냄새로 자신의 응답을 수정합니다 30 분에 매력적인 AWC - 감지 냄새 셋에 노출 된 후 ~ 1 시간의 chemotaxis 행동 분석에 적응 냄새를 무시합니다. 때 wildtype C. elegans 동물들은 후 AC에 적응 냄새를 무시합니다 ~ 1 시간을위한 매력적인 AWC - 감지 냄새에 노출되어~ 3 시간에 hemotaxis 행동 분석. C.의 후각 적응의 두 단계 elegans는 단기 후각 적응 (30 분 냄새에 노출 후 유도), 그리고 장기 후각 적응 (60 분 냄새에 노출 후 유도)로 설명했다. 나중에 L' Etoile의 외.에서 일, 4 AWC 뉴런의 단기 및 장기 후각 적응 모두 필요합니다 EGL-4라는 단백질 키나제 G (PKG)을 발견. EGL-4 단백질은 장기 후각 적응 반응하지만 AWC 4 단기 후각 적응 응답을위한 소모품에 필요한 핵 현지화 과정이 포함되어 있습니다. 녹색 형광 단백질과 태그 EGL-4함으로써, 장시간 냄새에 노출시 AWC의 EGL-4의 현지화를 시각화 할 수했습니다. 이 모든 기능을 사용하여 우리가 AWC 5 장기 후각 적응의 분자 표시 장치를 개발 할 수 있었던 EGL-4 (GFP :: EGL-4) 분자 GFP를 태그. 이 m을 사용하여후각 적응의 olecular 판독 우리는 AWC 6,7에서 GFP의 결함이 subcellular 지방화 패턴 :: EGL-4을 전시 돌연변이 동물을 식별하는 모두 순방향 및 역방향 유전 화면을 수행 할 수있었습니다. 여기 설명 : GFP 1) 건설 :: EGL-4 표현 동물, 2) 장기 냄새 유발 핵 translocation의 assays를위한 동물의 재배를위한 프로토콜 및 장기적인 악취 유발 3) 채점 핵 translocation 이벤트와 핵 GFP :: EGL-4 상태에서 복구 (재 sensitization).
프로토콜
1. GFP의 건설 EGL-4 표현 동물 태그
- odr-3 유전자 (직접 상류 시작 코돈의 사용 2,678 BP)를위한 발기인 아래 병진 융합 GFP :: EGL-4를 복제 (P) odr-3 :: GFP :: EGL-4. odr-3 프로모터 드라이브 amphid 뉴런 쌍 표현 : AWA, AWB, AWC, 그리고 약하게 ASH 인치
- (P) ofm-1 : 플라스미드 (P) odr-3 :: GFP :: 50 wildtype (N2) 동물에 EGL-4 표준 세균 라인 변환 기술 8을 사용 공동 분사 마커와 μl / NG를 삽입 : : GFP 9 일 (μl / 25 NG) 및 (P) odr-1 :: dsRed 10 (25 NG / μl). AWC 및 AWB amphid 뉴런 쌍의 odr-1 프로모터 드라이브 표현하고 coelomocytes의 ofm-1 프로모터 드라이브 표현.
- 울트라 바이올렛 (UV) / trimethylpsoralen (TMP) 통합 프로토콜 단계 1.2에 설명 된 extrachromosomal 배열을 표현 형질 전환 동물을 대상
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결과
AWC 전, 연장 냄새에 노출 후 GFP :: EGL-4in의 지역화 패턴의 예는 그림 2에 표시됩니다. 장시간 악취 노출, GFP :: EGL-4 이전은 AWC (그림 2B)의 세포 기질에 지역화하고 있으며, 80 분 냄새 노출 GFP 후 :: EGL-4는 AWC (그림 2D)의 핵에 번역되어 있습니다. 행동 수준에서 cytosolic GFP :: EGL-4 AWC에있는 동물은 냄새의 포인트 소스 (- chemotaxis 지수 3 가까운 1 되오니, 이용에 참고하여 그림 2C는 unadapted 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과를 그래프)에 매료됩니다. AWC에 핵 GFP :: EGL-4을 전시 동물은 적응 냄새 (- chemotaxis 지수는 제로에 가까운 되오니, 이용에 참고하여 적응 동물의 chemotaxis assays에서 그림 2E 그래프
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토론
GFP 태그 EGL-4 분자의 냄새 유발 핵 항목은 여기에 설명하는 것은 C.에서 후각 적응의 강력한 분자 기록을 제공합니다 elegans. 냄새 유발 핵 translocation의 assays은 간단하고 준비 시간을 몇 일을해야합니다. 우리가이 assays에 건설 한 pyIs500 동물은 AWC 신경 세포뿐만 아니라 GFP 태그 EGL-4 단백질을 표현을 비춰 마커를 표현합니다. 따라서, 우리는 뉴런의 클래스로 작업없이 경험이 거의있는 실험이 매우 빠르게합니다 (아마도 몇 다스의 동물을 검토 한 후) 핵 대 세포질 EGL-4에 대한 올바른 전지 및 채점을 식별 편안하게 할 수 있음을 느낀다. 독자는 C로 GFP 분석을 설명 기사 835를 목성을 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다 elegans 15.
생성 된 데이터는 최고 품질의 것을 보장하기 위해 우리는 다.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는이 원고의주의 읽기에 대한 스콧 해밀턴과 O'Halloran 연구실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 제안과 통찰력 의견을 익명 리뷰어를 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Bacto 한천 | Difco | DF0140 - 07-4 | NGM 플레이트 |
| 나트륨 염화물 | 피셔 화학 | S671-10 | NGM 플레이트 |
| Bacto 펩톤 | Difco | DF0118-07-2 | NGM 플레이트 |
| 이염 기성 인산 칼륨 | 피셔 화학 | S375-500 | S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 |
| 인산 칼륨 일 염기의 | 피셔 화학 | P285-500 | S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 |
| Kimwipes - 작은 | 킴벌리 - 클락 | LS2770 | |
| 에탄올 백퍼센트 | 골드 방패 화학(주) | 43196-115 | chemotaxis assays를위한 diluting 냄새 |
| 칼슘 염화물 | 시그마 - 알드리치 | C8106-500G | NGM 플레이트 |
| 마그네슘 황산염 | MP의 Biomedicals | 150136-500G | NGM 플레이트 |
| 나트륨 Azide 99% | 피셔 과학 | ICN10289180 | 마취제 |
| 아가로 오스 - UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | 아가로 오스 패드 |
| Benzaldehyde | 시그마 - 알드리치 | B1334-100G | AWC 냄새 |
| Butanone, ACS 학년 | 시그마 - 알드리치 | 360473-500ML | AWC 냄새 |
| Microcentrifuge 튜브 - 1.5 ML 컬러 | Denville | LS8147 | |
| 파스퇴르 Pipet 일회용 유리 5-3/4 " | 피셔 과학 | 13-678 - 20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV 통합 |
| 필터 진공 병 - 500 ML | Nalgene | 09-740 - 25B |
참고문헌
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimin....
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