Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

요약

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

초록

배의 세포를 모두 추적 계보 (Lineage)로 구성 운명의지도는 조직이 배의 각 셀에서 내려 어떤 알 수있다. 운명의지도 기관의 전구체를 식별와 후손 세포가 정상적인 배아에서 해당 기관을 채우는 것들로부터 발달 경로를 elucidating 매우 유용하지만, 그들은 전구체 세포의 전체 발달 가능성을 설명하거나 메커니즘을 식별되지 않는로 운명이 결정됩니다. 세포 운명의 노력에 대해 테스트하려면, 하나는 실험 조작 한 후 표현들과 함께 그대로 배아 (운명의지도)에 자손의 세포의 일반적인 레퍼토리를 비교합니다. 세포의 운명은 주변 세포 환경에 관계없이 (커밋) 고정, 또는 이웃에 의해 제공 외부 요인에 의해 그 영향을 받는가? Xenopus의 배아의 종합 운명지도를 사용하여, 우리는 확인하는 방법에 대해 설명합니다, 격리 및 문화 단일 절단 단계의 전구체, blasto라고meres. 이 방법은 하나가 이러한 초기 세포가 그들의 이웃 세포와의 상호 작용이 필요 손상 배아에서 자신의 정상적인 환경에서 획득 운명에 최선을 다하고 있습니다, 또는 신호의 다른 유형에 노출하는 경우 다른 운명을 표현하는 영향을 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

서론

Xenopus laevis의 배아들은 달걀 microsurgical 접근 방식을 허용 할 수있을만큼 크기 때문에 배아 세포가 특정 운명을 취득하는하여 메커니즘을 식별 할 수 광범위하게 활용되었습니다. 각 셀은 고유 에너지 저장소를 제공 난황의 혈소판의 풍부한 세포 공급을 포함되어 있기 때문에 또한, 그들은 문화 매체의 영양 보완 필요없이 외부 개발할 수 있습니다. ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} - 세포의 운명이 결정되는이 메커니즘을 연구하는 중요한 자산이 (32 세포 단계를 통해 2) 절단 단계의 blastomeres의 운명지도의 종합 세트입니다. 이지도는 하나의 식별 blastomere으로 감지 분자를 microinjecting와 조직이 표시 자손에 의해 채워하는 후 개발의 모니터링에 의해 구축되었다. 배아의 추기경 축 안정적으로 많은 엠브리에서 확인 할 수 있기 때문에 일관성있는 운명의지도는 가능합니다OS. 식물 반구이 아닌 반면, 첫째, 모든 야생를 입력 배아에 동물 반구는 색소입니다. 둘째, 기름지게에서 정자의 항목은 미래 복부 편으로 동물 반구의 착색의 수축을 초래, 많은 배아에 착색 차이 따라서 등쪽과 복부 측면 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 첫 번째 절단의 고랑 따라서 중간 시상 대부분의 배아에서 비행기, 그리고는 배의 오른쪽과 왼....

프로토콜

1. 악기, 문화 미디어와 요리 준비

1. 알루미나 연마 필름을 사용하여 네 포셉을 선명하게. 팁 크기를 모니터링 할 수있는 해부 현미경으로이 작업을 수행합니다. 포셉 중 하나 쌍은 백업 경우에는 팁이 절차를 수행하는 동안 손상된 역할을합니다. 네 개의 집게를 압력솥과 멸균 용기에 보관하십시오.
2. 및 필터 소독, 500 ML 0.1X와 1.0X 문화 매체의 각 ⁽¹⁵ 조리법 중 마크의 수정일 Ringers는 [MMR] 또는 수정일 바스의 식염 [MBS])가합니다. 우리는 정기적으로 MBS를 (; 1 ㎜ KCl, 0.7 MM CaCl _2, 1 MM MgSO _4, 5 밀리미터 HEPES [산도 7.8], 2.5 MM NaHCO ₃ 1X = 88 MM NaCl)을 사용합니다. 개월 동안 14-18 ° C에서 저장합니다.
3. 문화 매체 (나사 캡 유리 병에 100 ML 1X 문화 매체에 2g 전기 등급 아가로 오스)의 2 % 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 아가로 오스를 해산하기 위해 압력솥. 이것은 달 동안 4 ° C에 저장하고,이 다음에 필요할 때 아가로 오스를 녹일 수있는 microwaved 할 수 있습니다.
4. 아가로 오스는 액체이지만, 멸균 24도 ....

결과

정확하게 세포의 발달 잠재력을 평가하는이 분석의 능력 운명에지도 ^{1, 2, 3, 4, 5, 6을} 기반으로 올바른 blastomere을 해부에 의존하고 있습니다. 따라서 이후 그림 2에 도시, 정기적으로 절단 패턴을 준수 그림 1에 도시 된 바와 같이, 2 셀 단계에서 올바른 착색 패턴 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 하나가 필요한 절단 단계에 도달로 정렬 배아를 관찰하고 불규칙 cleavages을 보여 배아를 분리하는 경우, 정확성이 크게 향상됩니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 일반 cleavages는 주로 배의 한쪽에 발생합니다. 기증 셀 '일반'편에서 유래하는 경우 이러한 배아는 기증자으로 사용할 수 있습니다. 당신이 해부하고자하는대로 정기적으로 절단 패턴은 많은 배아 등 5 회 정도 세포 분열 진행, 정렬 등의 적은 배아에서 발견되기 때문에. 당연히 Fertilized 알은 체외 수정 된 .......

토론

개인 blastomeres 성공적으로 배양하기위한 가장 중요한 단계는 1) 제대​​로 관심 blastomere 식별, 필요한 매뉴얼을 개발하고 4), 살균, 건강한 문화를 유지 2), 3) 세포주기의 정확한 부분에서 박리 세포를 해부하는 동안 손상을 방지하고 잘 문화에 전송하는 민첩성.

특정 blastomeres를 조작하려면, 그것은 추기경의 축을 식별 할 수 있도록 필수적입니다. Xenopus의 배아에서 등쪽의 측면은 세 가지 방법으로 식별 할 수 있습니다 (2) 팁의 체외 계란은 수정 된 한 쪽 ^{18, 19를} 표시 (1) 중요한 염료 ^{18, 19로} 정자 진입 지점을 표시하거나 (3) 첫 번째 절단의 고랑은 동물 반구 ^{20, 21에} 가볍게 색소 지역을 양분하는 2 세포 단계에서 배아를 선택합니다. 우리는 정확하게 자연스럽게 - fertiliz에서 b​​lastomeres를 식별 할 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
알루미나 연마 필름	토마스 과학	# 6775E-38	포셉 팁의 주요 수리 과정 (12 μm),
알루미나 연마 필름	토마스 과학	# 6775E-46	포셉 도움말을 선명하게 잘 대해 보통 (3 μm)
알루미나 연마 필름	토마스 과학	# 6775E-54	포셉 도움말 연마를위한 고급 (0.3 μm)
집게 : 뒤몽, Dumoxel Biologie # 5	정밀 과학 도구	# 11252-30	이 처음 구입했을 때 선명하게 필요하지 않는 좋은 방법이 있습니다. 부식 방지가 할 수 있도록autoclaved합니다.
Gentamicin 솔루션	시그마	G1397	사용과 같은 날에 중간에 추가