방법 논문

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

DOI:

10.3791/50004

⸱

2012년 10월 29일

 , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine (BCM), 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine (BCM), 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital

이 논문에서

요약

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optogenetics의 개발은 이제 정확하게 유전자 정의 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 방법을 모두 제공합니다 체외에서와 생체 내. 여기 뇌 조직의 만성 photostimulation에 광 섬유의 조립 및 주입을 설​​명합니다.

초록

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neuronal 연결의 Elucidating 패턴은 임상과 기초 모두 신경 과학에 대한 도전이었다. 전기 생리학은 시냅스 연결의 패턴을 분석 황금 표준 왔지만 짝 electrophysiological 레코딩 성가신와 실험적으로 제한을 모두 할 수 있습니다. optogenetics의 발달은 체외 1과 생체 2,3에서 모두 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 우아한 방법을 도입하였습니다. 이산 neuronal 인구에 옵신 표현을 유도 세포 유형의 특정 발기인의 활동을 이용하여, 하나는 정확하게 구별 회로 4-6에서 유전자 정의 neuronal 하위 유형을 자극 할 수 있습니다. 전기 자극 및 / 또는 약리 조작 등의 뉴런을, 자극에 잘 설명 방법은 종종 침입 세포 유형의 무차별이고, 주변 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 이러한 제한은 전형적인 시냅스 기능 및 / 또는 회로의 동작을 변경 수 있습니다. 또한, 인해조작의 성격에, 현재의 방법은 종종 급성 및 단말 있습니다. Optogenetics는 비교적 무해한 방식으로 뉴런을 자극하고, 유전자 타겟으로 뉴런에 할 수있는 능력을 갖게. 생체 optogenetics에 관한 연구의 대부분은 현재 주입 캐뉼라 6,7를 거치게 광학 섬유를 사용하지만,이 방법의 한계는 광섬유의 반복 삽입과 손상된 뇌 조직과 캐뉼라 내부의 섬유의 잠재적 인 파손이 포함되어 있습니다. optogenetics의 급성장 분야 감안할 때, 만성 자극의 더 신뢰할 수있는 방법은 최소한의 부수적 인 조직 손상과 장기 연구를 촉진 할 필요가 있습니다. 여기 효과적이고 우아 스파르타 외에 설명 된 방법을 보완하기 위해 비디오 기사 등의 수정 프로토콜을 제공합니다. 8 anesthetized 마우스의 두개골로 광섬유 이식 및 영구 고정의 제조뿐만 아니라의 조립에 섬유광 커플러는 광원에 임플란트를 연결. 고체 레이저를 광섬유로 연결 임플란트는 만성 적은 조직 손상 9 작은 분리, tethers을 사용하여 기능 neuronal 회로를 photostimulate 할 수있는 효율적인 방법을 할 수 있습니다. 광섬유 임플란트를 영구적으로 고정을 제공 일관 최소한의 조직 손상을 갖춘 10 개 깨어 행동 쥐 neuronal 회로의 생체 optogenetic 연구의 장기.

프로토콜

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각 제조업체 및 / 또는 공급 업체와 함께 * 모든 자료는 프로토콜 아래에 나열되어 있습니다.

1. 임플란트의 조립

  1. 수지의 1g에 경화제의 100 밀리그램을 추가하여 열 경화 ​​광섬유 에폭시의 혼합물을 준비한다.
  2. 측정 및 쐐기 팁 초경 서기로 골의 100 μm 코어와 광 125 μm 섬유의 약 35mm를 잘라. 단일 방향 운동에서 광 섬유 및 점수에 서기 수직를 배치합니다. 섬유를 절단하는 것은 완전히 섬유 코어가 손상됩니다.
  3. 부회장에 구멍 127 μm로 물미 LC 세라믹을 삽입, 볼록면은 아래 지적했다.
  4. 페럴에 광 섬유를 삽입합니다. 광 섬유 부드럽게 밀어과 영특 페럴 (그림 1a)의 볼록 넘어 돌출한다.
  5. 에폭시는 검은 색 변까지 열 총을 평면 엔드와 열에 열 경화 ​​광섬유 에폭시 한 방울을 적용합니다. 에폭시는해야이 가열 및 이전 치료 될 때 페럴을 입력합니다. 에폭시는 일정한 열 응용 프로그램의 ~ 1 분 이내에 치료해야합니다.
  6. 이 커플러와 인터페이스를 방해하므로, 페럴의 측면을 따라 모든 에폭시를 제거합니다.
  7. 연마 패드의 알루미늄 산화물 연마 시트 (그림 1b....

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토론

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Optogenetics 특정 neuronal 하위 유형 통해 전례없는 제어를 할 수있는 강력하고 새로운 기술입니다. 전극을 통해 셀 타입 무차별 및 전기 자극의 침해 효과를 피하는 동안이는 해부학과 측두엽 정밀도와 신경 회로를 조절하기 위해 악용 할 수 있습니다. 섬유 광학의 주입은 조직에 최소한의 손상과 쥐 행동, 깨어에서 여러 세션을 통해 신경 회로의 일관성, 만성 자극 할 수 있습니다. 이 시스템은 원래 스파르타 외에 의해 개척. 8 우리의 목적에 맞게 수정이 주입 된 캐뉼라보다 한 단계에 들어갔 및 장기 연구에서 세션 사이에 타겟팅 일관성을 보장하기 위해 관심 영역의 위치에 광 섬유를 해결할 수 있습니다. 임플란트는 뇌의 다른 영역을 자극하도록 구성 할 수 있습니다.

이 방법에서 다양한 단계 세부에 정밀도와 관심이 필요합니다. 광섬유 커플 링의 각 교차점입​​니다반드시 최소한의 빛 손실을 보장하기 위해 연마. 연마 후, 끝은 섬유 코.......

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감사의 글

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이 기술은 원래 스파르타 외., 2012 년까지 설명한 쉽게 우리가 실험실에서 사용하기 위해 적응 된 것을 인정하고 싶다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약이나 장비의 이름 회사 카탈로그 # 코멘트
LC 페럴 슬리브 정밀 섬유 제품 (PFP​​) SM-CS125S 1.25 mm의 ID
FC MM 사전 조립 된 커넥터 PFP MM-CON2004-2300 230 μm은 페럴
밀러 FOPD-LC 디스크 PFP M1-80754 LC ferrules에 대한
분기 관 PFP FF9-250 900 μm OD, 250 μm의 ID
MM LC 스틱 1.25 mm를 페럴 PFP MM-FER2007C-1270 127 μm의 ID 보어
MM LC 스틱 1.25 mm를 페럴 PFP MM-FER2007C-2300 230 μmID 보어
열 경화 ​​에폭시, 경화제와 수지 PFP 동부 표준시 - 353ND-16OZ
FC / PC와 SC / PC 커넥터 연마 디스크 ThorLabs D50-FC FC ferrules에 대한
디지털 광학 전력 및 에너지 미터 ThorLabs PM100D 분광 광도계
폴리싱 패드 ThorLabs NRS913 9 "X 13"50 Durometer
0.3, 1, 3, 5 μm 모래 : (폴리싱) 시트를 래핑 알루미늄 산화물 ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
표준 하드 Cladding 멀티 섬유 ThorLabs BFL37-200 낮은 OH, 200 μm 코어, 0.37 NA
섬유 스트리핑 도구 ThorLabs T10S13 클래드 / 공동의 : 200 μm / 300 μm
실리카 / 실리카 광섬유 Polymicro 기술 FVP100110125 높은-OH, UV 향상된, 0.22 NA
1x1 Fiberoptic 로타리 조인트 도리스 식 렌즈 FRJ_FC - FC
모노 Fiberoptic Patchcord 도리스 식 렌즈 MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
튜브, 1 / 8 인치를 축소 가열 연합 전자 689-0267
열 총 연합 전자 972-6966 250 W, 750-800 ° F
면화는 applicators 팁을 청교도 의료 제품 회사 806-WC
VetBond 조직 접착제 피셔 과학 19-027136
플래시 의치베이스 아크릴 예이츠 Motloid ColdPourPowder + Liq
본 미니 창포 가위 Integra Miltex 18-1392 3-1/2 "(8.9cm), 직선, 15mm 블레이드
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탐침 정밀 과학 도구 10140-02
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가중치 기반으로 바이스 Altex 전자 PAN381

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural ....

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